INCDA Fundulea

Proiecte de cercetare

PCCA 99/2012

(english version)

Sumar:
Etapa I
Etapa II
Etapa III
Etapa IV
Etapa V trimestrul I
Etapa V final

• Poster USAMVB

• Poster INCDA Fundulea

• Anexe - Etapa V

Numar contract: PCCA 99/2012
Titlul proiectului:  Abordarea fenotipică şi moleculară a ameliorării rezistenţei durabile, de plantă adultă (slow-rusting, nespecifică) a grâului (Triticum aestivum) la rugina brună (Puccinia triticina).
Autoritatea contractanta: Unitatea Executivă pentru Finanţarea Învăţământului Superior a Cercetării Dezvoltării şi Inovării - UEFISCDI
Durata: 2012-2015;
Participanti:
Coordonator: Institutul National de Cercetare Dezvoltare Agricola (INCDA) Fundulea;
Partener 1: Universitatea de Stiinte  Agricole si Medicina Veterinara Bucuresti (USAMVB);
Partener 2: Statiunea de Cercetare Dezvoltare Agricola (SCDA) -Livada;
Partener 3: Statiunea de Cercetare Dezvoltare Agricola (SCDA) -Pitesti;
Scopul proiectului: Obtinerea in faza de pre-ameliorare a unei germoplasme romanesti cu rezistenta de planta adulta, de tip slow-rusting, nespecifica, in scopul accelerarii procesului de obtinere a noilor soiuri de grau caracterizate prin rezistenta durabila si insusiri agronomice valoroase.   

Obiectivele proiectului:
(1)analizarea diversitatii populatiilor locale de Puccinia triticina prin a)inocularea diferentialilor in faza de plantula si pe fragmente de frunze detasate (Arraiano et al., 2001) si  b)analiza ADN;
(2)caracterizarea expresiei fenotipice a rezistentei de tip slow-rusting  in faza de plantula  (inoculare artificiala) si planta adulta (infectie artificiala si naturala);
(3)aplicarea tehnicilor moleculare pentru postularea genelor de rezistenta (Lr)  care confera rezistenta de tip slow-rusting in germoplasma proprie de ameliorarea graului si selectia descendentelor incrucisarilor dintre purtatorii acestor gene si genotipuri avansate (MAS).

REZULTATE ESTIMATE:
-a) obtinerea de informatii privind structura de virulenta in populatii locale romanesti de Puccinia triticina, cu aplicatii practice pentru ameliorarea rezistentei si reducerea pagubelor economice produse de rugina bruna in cultura graului;
-b) depasirea barierelor tehnice si/sau stiintifice de utilizare pe scara larga a selectiei asistate de markeri moleculari (MAS) pentru dezvoltarea rezistentei durabile la rugina bruna in programul romanesc de ameliorarea graului;

Premise:
-genele tinta de rezistenta multipla de tip slow-rusting, in particular noua gena catalogata in aceasta clasa de resistenta, respectiv Lr 67/Yr46, nu a fost inca introdusa sistematic in germoplasma globala adaptata de grau de toamna;
-germoplasma curenta de grau de toamna creata in Romania  contine genotipuri de perspectiva cu insusiri agronomice imbunatatite, dar pentru a putea fi cultivate eficient in conditiile schimbarilor climatice prognozate, introducerea rezistentei durabile multiple la majoritatea patogenilor cu transmitere aeriana este esentiala;
-diversificarea, prin materialul original rezultat in cadrul proiectului, a substratului genetic al rezistentei la rugina bruna in gemoplasma romaneasca de grau de toamna actuala, utilizata pentru obtinerea noilor soiuri, competitive din punct de vedere economic si social pe piata graului, la nivel national si international.

 

REZULTATE OBTINUTE PANA IN PREZENT:

 Etapa I: Caracterizarea preliminara a reactiei genelor de rezistenta la rugina bruna (Lr) fata de populatiile locale de Puccinia triticina in germoplasma de grau initiala–Ciclul 0.

REZUMAT

In perioada analizata au fost planificate si realizate de catre participantii la proiect, in conditii de camp si laborator, urmatoarele activitati experimentale:

1-Fenotiparea rezistentei la rugina bruna; prelevarea de probe din populatii locale de P. triticina;

Coordonatorul proiectului si partenerii P2 si P3 au efectuat caracterizarea rezistentei la germoplasma de grau initiala (Ciclul 0), constand din 95 soiuri de grau, romanesti si straine si >400 de linii in  stadii avansate de ameliorare, ceea ce a permis selectia pentru acest caracter si constituirea unui sortiment de cca 200 genotipuri specifice obiectivelor proiectului-(Ciclul 1), utilizat pentru infiintarea dispozitivelor experimentale-Anul I la Fundulea, Livada si Pitesti si continuarea lucrarilor de fenotipare si genotipare planificate.
In  conditiile anului 2012, au fost prelevate si conservate probe de uredospori de P. triticina din populatii locale de la Fundulea, Livada si Pitesti, constituindu-se setul initial de material fungic (setul nr.1), ceea ce  a permis initierea analizelor la nivel molecular ale patogenului la USAMVB(P1) si a infectiilor artificiale prevazute pentru aceasta etapa la INCDA Fundulea (CO) si USAMVB (P1).

2- Obtinerea de izolate monopustulare din populatii locale de P. triticina si testarea unor metode de extractie a ADN-ului fungic;

-In urma aplicarii a diferite metode de infectie artificiala, s-au putut reproduce simptomele de rugina in experimentele efectuate la INCDA Fundulea(CO) si USAMVB(P1). Pentru cresterea productiei de spori si a numarului de izolate monopustulare de P. triticina se va continua perfectionarea protocolului specific;
-Dintre metodele experimentate de izolarea ADN de la P.triticina la USAMVB, pe baza pe CTAB si kituri comerciale, s-a demonstrat superiorittaea kit-ului OmniPrep for Fungus (Geno Tech, USA), în varianta O1 (dezintegrarea sporilor prin tratament enzimatic şi mecanic), care a permis obţinerea unor cantităţi mai mari de ADN cu o puritate relativ ridicată, ceea ce justifica utilizarea sa in etapele viitoare de realizare a proiectului.

3- Genotiparea rezistentei la rugina bruna de tip slow rusting cu markeri specifici pentru genele tinta (Lr34/ Lr46/Lr67);

Analizele moleculare efectuate cu markerii functionali STS-csLV34 si  cssfr5, în cadrul acestei etape, la 100 genotipuri de grau, au evidenţiat frecventa ridicata (>55%) a genotipurilor homozigote pentru alela rezistenta a genei Lr34, care confera rezistenţa durabila la rugina brună (APR). Acest rezultat reprezintă un prim pas în aprecierea rezistenţei soiurilor şi liniilor de grâu româneşti la rugina brună, utilizând analize moleculare, iar, odată cu alegerea şi optimizarea protocoalelor pentru cei mai potriviţi markeri moleculari asociaţi altor gene implicate în rezistenţa durabilă a grâului la rugina brună (Lr46, Lr67, etc.), piramidarea acestor gene şi obţinerea in mod particular, de soiuri cu acest tip de rezistenţă la rugina brună va fi mult mai uşor de realizat.Genotipurile analizate la nivel molecular au fost incluse in germoplasma proiectului ( Ciclul 1), componenta a dispozitivului experimental-Anul I, urmand sa fie analizate si fenotipic la Fundulea, Livada si Pitesti.

4-Stabilirea sortimentului specific de genotipuri-(Ciclul 1) si infiintarea campului experimental-An I

In perioada optima pentru cultura graului (septembrie-octombrie), au fost infiintate patru dispozitive experimentale-Anul I, in localitatile Fundulea (2), Livada si Pitesti, continand  materialul biologic divers si adecvat selectionat in raport cu obiectivele asumate.
Astfel, se considera ca in ansamblu s-au obtinut rezultatele scontate pentru aceasta etapa si sunt premise pentru continuarea celorlalte activitati planificate in cadrul proiectului, precum si diseminarea rezultatelor prin comunicare la manifestari stiintifice si un articol publicat.

 

Etapa II: 2013-ianuarie - decembrie

Denumirea etapei: Evaluarea structurii virulenţei în populaţiile locale de P. triticina şi selecţia pentru rezistenţa parţială de plantă adultă (APR), de tip slow-rusting în germoplasma de grau-Ciclul 1 

Activitatea II.1: Fenotiparea rezistenţei la rugina brună în faza de plantulă şi plantă adultă; prelevarea de probe din populaţii locale de P. triticina.

Fenotiparea rezistenţei în faza de plantulă s-a realizat la Fundulea (CO), în perioada ianuarie-mai şi septembrie-noiembrie 2013. Etapele parcurse au constat din validarea protocolului de infecţie artificială cu rugină brună pe fragmente de frunze detaşate şi plantule, în condiţii controlate. Aplicarea ambelor tehnici de lucru, a permis obţinerea primelor izolate monopustulare, extrase din nouă populaţii locale prelevate în anul 2012 şi 2013 în condiţii de câmp din localităţile Fundulea, Livada şi Albota. A fost caracterizată, pe baza sistemului specific de notare (Tipul de infecţie: 0 FR-4 FS), reacţia fenotipică de rezistenţă şi sensibilitate, în faza de plantulă, la un număr de 100 genotipuri româneşti şi străine, aflate în dispozitivul experimental-Anul I (ciclul 2012/2013). Aceste date au fost coroborate cu rezultatele obţinute în faza de plantă adultă şi cele rezultate din analizele la nivel molecular.

 

Fig. 1. Testarea rezistenţei la rugina brună în faza de plantulă

Fig. 2. Fenotiparea reacţiei la rugina brună în faza de plantă adultă la genotipuri purtătoare ale genei Lr34 (mijloc & dreapta), comparativ cu  genotip Lr34-(stanga).

Fenotiparea rezistenţei în faza de plantă adultă s-a realizat la Fundulea (CO), Livada (P2) şi Albota (P3), localităţi unde au fost înfiinţate în condiţii optime dispozitive experimentale în toamna anului 2012. Contextul climatic în care s-au desfăşurat lucrările de testare în anul 2013, a fost marcat la Fundulea şi Livada de un excedent de precipitaţii şi alternanţa rapidă de perioade caracterizate prin temperaturi medii şi maxime mai mari faţă de mediile multianuale. Aceste condiţii au favorizat intensificarea co-contaminarii plantelor cu diverşi patogeni foliari, între care Septoria tritici a fost prevalentă şi s-a manifestat cu intensitate mare. De asemenea, s-a observat o incidenţă crescută faţă de anii trecuţi, a atacului de rugină neagră. La Albota, condiţiile climatice au fost caracterizate, din contra, prin deficit de precipitaţii. Aceste condiţii au afectat exprimarea la un nivel ridicat şi evoluţia normală a atacului de rugină brună în localităţile Livada şi Albota. Datorită modului de amplasare al fiecărei variante experimentale între două rânduri de spreaderi de sensibilitate, specific punerii în evidenţă a tipului de rezistenţă slow-rusting şi asigurării unui fond de infecţie artificială, s-au putut realiza în toate localităţile 2-4/cicluri de observaţii cu privire la intensitatea atacului (%) şi tipul de rezistenţă şi anume: Fundulea: (20.05; 27.05; 7.06); Albota (10.05; 17.05; 27.05; 18.06); Livada (5.06;12.06;18.06). Astfel, a putut fi realizată caracterizarea comparativă a reacţiei la rugina brună a celor 100 genotipuri de grâu de toamnă analizate în această etapă de lucru.

 

Fig. 3. Nivel maxim de infecţie manifestat în dispozitivele experimentale realizate la Albota (stânga) şi Livada (dreapta) în anul 2013.

 

La Fundulea au fost analizate în faza de plantă adultă şi descendenţele hibride (F1 şi F2), provenite din incrucişări între genele ţintă pentru rezistenţa durabilă de tip slow-rusting, Lr34, Lr 46 şi Lr67 cu liniile româneşti adaptate, Glosa (Lr34+) şi Miranda (Lr-).

 

Fig. 4. Reacţia fenotipică slow rusting conferită de genele specifice de rezistenţă: Lr34; Lr46 şi Lr67 (de la stânga la dreapta) Fundulea 2013

Utilizarea soiului Glosa în combinaţii cu linii purtătoare ale genei Lr34 şi Lr46, s-a efectuat în scopul piramidării celor două gene de rezistenţă durabilă, precum şi de a evidenţia eventual şi prezenţa altor gene de rezistenţă la rugina brună.
Caracterizarea fenotipică a rezistenţei durabile s-a realizat prin aprecierea la intervale succesive (trei serii) a tipului de infecţie (TI=R, MR, MS, S) şi a procentului de atac pe frunze (% pustule). Rezultatele au fost exprimate prin TI, observat în faza maximă de atac (7.06.2013), iar procentul de atac pe baza indicelui sintetic AUDPC, un bun indicator pentru tipul de rezistenţă slow-rustin şi anume: valoarea scazută a AUDPC sugerează un progres al atacului mai lent şi în consecinţă, pagube economice mai reduse. Rezultatele obţinute în populaţiile F2 (Lr34/Glosa, 111 plante) şi (Glosa/Pavon 76, 69 plante) au evidenţiat variabilitatea mare a acestui parametru. La un număr important de plante F2, s-a evidenţiat un nivel de rezistenţă superior liniei adaptate Glosa, ceea ce asigură continuarea lucrărilor şi posibilitatea identificării de genotipuri valoroase pentru atingerea obiectivului final al proiectului si implicit pentru propriul program de ameliorare. Întregul sortiment (170 genotipuri) a fost analizat şi la nivel molecular, cu markeri specifici pentru ambele gene de rezistenţă Lr.
Prelevarea a cca 50 noi probe din populaţiile locale de Puccinia triticina din toate localităţile, unde au fost observate focare de infecţie naturală, astfel că în cursul acestei etape a rezultat un sortiment lărgit de izolate monopustulare ale patogenului (cca 30).

 Activitatea II.2: Fenotiparea si genotiparea diversitatii virulentei la populatiile de P. triticina analizate (2012 si 2013)

Coordonatorul a analizat până în prezent reacţia de virulenţă/avirulenţă a unor izolate monopustulare de Puccinia triticina, obţinute din populaţii locale de la Fundulea şi Albota, utilizând în faza de plantulă un sortiment standard alcătuit din 17 diferenţiatori (gene de rezistenţă Lr). Până în prezent s-a constatat că există diferenţe între izolatele analizate, majoritatea acestora având formula de avirulenţă/avirulenţă: Lr1; Lr2a; Lr2b; Lr9; Lr16; Lr20; Lr23/Lr2c; Lr3; Lr3bg; Lr3ka; Lr10; Lr14a; Lr15; Lr17; Lr26; Lr37.
Probele de Puccinia triticina analizate la nivel fenotipic au fost analizat la USAMVB (P1), în vederea studierii virulenţelor la nivel molecular cu metodele: kit OmniPrep şi CTAB, care au fost testate comparativ şi parţial, optimizate. ADN obţinut a fost analizat la nivel molecular cu primeri: decamerici RAPD(8), SSR(15 primeri) şi ISSR (2). In cadrul acestei activităţi s-au obţinut rezultate încurajatoare privind continuarea analizelor planificate în cadrul proiectului la nivel molecular privind ADN fungic, prin aplicarea tehnicilor specifice, deja optimizate sau in curs de optimizare şi la izolatele care se vor obţine în următoarele etape. Populaţiile şi izolatele de Puccinia triticina analizate, au evidenţiat omogenitate ridicată şi respectiv, un polimorfism relativ scăzut.

Diseminarea rezultatelor. A fost elaborată lucrarea Detection of molecular polymorphism of Puccinia triticina from wheat in Romania. Autori: L. D. Dinu, C. Diguta, M. Ciuca, L. Ursu, C. P. Cornea, aflată în curs de evaluare la Scientific Bulletin.Series F. Biotechnologies. ISSN 2285-1364, ISSN ONLINE 2285-1372 (http://biotechnologyjournal.usamv.ro/)

Activitatea II.3: Selecţia asistată de markeri moleculari specifici pentru rezistenţa parţială de plantă adultă (APR) de tip slow-rusting, conferită de genele Lr34, Lr46 si Lr67, în vederea cumulării acestora în germoplasma românească adaptată de grâu.

Coordonator: S-au efectuat analize moleculare cu markerul funcţional CAPS-cssfr6/Fnu4HI, care face diferenţa între alelele genei Lr34 prin polimorfismul existent la nivelul exonului 12 la 100 de soiuri şi linii de grâu de toamnǎ. Analizele moleculare efectuate cu acest marker au evidenţiat aceleaşi rezultate ca şi markerul cssfr5 cu excepţia soiului Favorit. In cazul acestui soi s-a obţinut un produs PCR diferit de al celorlalte genotipuri analizate, în plus, acest produs PCR nu a fost clivat cu enzima de restricţie Fnu4HI. Acest rezultat sugereazǎ existenţa unui polimorfism la nivelul exonului 12 al genei Lr34 din soiul Favorit. Pentru confirmarea acestui rezultat se vor efectua mai multe izolǎri de ADN(3-5) din acest soi, urmând a se realiza amplificarea şi clivarea acestor probe.
In vederea evidenţierii alelelor genelor Lr34, Lr46 şi Lr67 s-au desfǎşurat urmǎtoarele activitǎţi la generaţiile aflate în segregare în câmpul experimental înfiinţat la Fundulea în condiţii de irigare: a)Izolare de ADN genomic din frunze; b)Reacţia de amplificare ADN (PCR) şi c)Electroforeza produşilor PCR în gel de agarozǎ şi/sau poliacrilamidǎ.
a)Izolarea de ADN s-a realizat din frunzele tinere de grâu recoltate din câmp (4 frunze/variantă), folosind un protocol pe bază de CTAB (cetiltrimetilamoniubromide).
Analiza molecularǎ pentru evidenţierea prezenţei alelei de rezistenţǎ a genei Lr34. Au fost analizate douǎ populaţii, totalizănd 170 de genotipuri de grâu de toamnă (F2) originale, obţinute la INCDA Fundulea din încrucişări cu gena de rezistenţă Lr34.
Analiza molecularǎ pentru evidenţierea prezenţei alelei de rezistenţǎ a genei Lr46. S-a analizat o populaţie segregantǎ derivată din combinaţia Glosa/Pavon76, unele soiuri şi linii de grâu cu markerii moleculari: G22-(cu clivarea produsului prin utilizarea endonucleazei de restricţie BspEI); csHM46 şi wmc44. Secvenţa primerilor primilor doi markeri moleculari- G22, respectiv csHM46, cât şi protocolul de lucru au fost obţinute direct prin acord de transfer material de la renumitul specialist, Dr. Evans Lagudah (CSIRO-Plant Industry, Australia. Dintre markerii utilizaţi, numai markerul wmc44 a evidenţiat polimorfism la nivelul pǎrinţilor şi la nivelul populaţiei segregante, atât pe gel de agarozǎ (2%), cât şi pe gel de poliacrilamidǎ, fiind identificate următoarele stări: i) homozigoţie pentru alela de rezistenţǎ a genei Lr46 (Lr46+)-6 genotipuri, heterozigoţie (Lr46+Lr46-)-44 genotipuri, homozigoţie pentru alela de sensibilitate a genei Lr46 (Lr46-)-7 genotipuri. Din analiza comparativă a rezultatelor privind prezenţa alelor de rezistenţǎ ale genelor Lr34 şi Lr46, s-a constatat prezenţa ambelor gene (piramidarea genelor Lr34 şi Lr46) în linia DuRes-116/2013.

Diseminarea rezultatelor. Rezultatele obţinute până în prezent au făcut obiectul a două expuneri orale, prezentate de dr. Matilda Ciuca:
-Caracterizarea molecularǎ a stării alelice a genei Lr34 în germoplasma româneascǎ de grâu în cadrul Simpozionului “ Preocupǎri Actuale şi de Perspectivǎ în Genetica Vegetalǎ şi Animalǎ”-Autor: M. Ciucă (20 iunie 2013, Bucureşti, ASAS);
-Evidenţierea molecularǎ a prezenţei genei Lr34, asociatǎ rezistenţei durabile la rugina brunǎ, în germoplasma româneascǎ de grâu. Autor: M. Ciucă (Sesiunea Internă de Referate a INCDA Fundulea, 26 martie 2013).

Concluzii activitate
În urma analizelor moleculare efectuate în Etapa 2 (2013), cu markeri moleculari robuşti şi tehnici diferenţiate de lucru, s-au identificat genotipuri purtătoare ale alelelor de rezistenţă în stare homozigotă pentru fiecare din genele de rezistenţă durabilă ţintă, Lr34 şi Lr 46, precumşi o linie la care cele două gene sunt piramidate (DuRes-116/2013), toate acestea fiind fost incluse în dispozitivele experimentale-Ciclul 2 (2013/2014), înfiinţate în toamna anului 2013. Complexitatea şi noutatea abordării moleculare pentru identificarea noii gene de rezistenţă durabilă, Lr67 (2010), în descendenţe ale combinaţiilor cu linii adaptate româneşti, precum Miranda (Lr67-) cu linia RL6077 (Lr67+), impune aprofundarea cercetărilor şi analizarea unui număr mai mare de populaţii segregante, nu numai cu markerul deja utilizat cfd71.

 

Activitatea II.4: Stabilirea sortimentului specific de genotipuri-Ciclul 2 şi înfiinţarea câmpului experimental An II.

Această activitate s-a finalizat pe baza datelor experimentale obţinute prin analize fenotipice, efectuate la Fundulea (Coordonator), Livada (P2) şi Albota (P3), precum şi moleculare (Coordonator). În lunile octombrie-noiembrie s-au înfiinţat patru noi dispozitive experimentale în localităţile Fundulea (irigat şi neirigat); Livada şi Albota, ce au inclus linii provenite din combinaţii directe, backcross şi topcross între genele de rezistenţă durabilă ţintă şi liniile avansate româneşti: Glosa, Miranda, Boema, aflate în generaţiile F1 (T=27), F2 (577) şi F3 (120). Materialul biologic a fost obţinut la INCDA Fundulea în câmp, seră şi casa de vegetaţie, în cea mai mare parte (linii F1 şi F2) în timpul derulării proiectului. Schema experimentală utilizată prevede alternanţa Spreader sensibil/linie segregantă la un nivel optim stimulării atacului de rugină brună în perioada de vegetaţie 2014 şi include descendenţele hibride şi părinţii acestora, totalul variantelor de analizat variind între 192(F3)-750 (F2). Infiintarea experienţelor s-a realizat în condiţii optime de umiditate în sol şi temperaturi favorabile pentru germinare, răsărire şi creştere la Fundulea şi Livada, spre deosebire de localitatea Albota (SCDA Piteşti), unde datorită excesului de precipitaţii din luna octombrie, această activitate a fost decalat în afara epocii optime. Totuşi şi în acest caz regimul termic favorabil înregistrat a permis răsărirea bună a parcelelor experimentale, plantele aflându-se, la instalarea temperaturilor scăzute, în faza de două frunze.

Activitatea II.5.1: Organizarea de întâlniri în cadrul consorţiului (mese rotunde; vizite cămpuri experimentale etc).

Coordonatorul a organizat următoarele întâlniri în cadrul consorţiului privind desfăşurarea proiectului: a) întâlnire de informare cu privire la stadiul de realizare a proiectului cu partenerii SCDA Livada (P2) şi SCDA Piteşti (P3), în data de 20 mai 2013, la ASAS şi b)masa rotundă (ASAS, iulie), pentru prezentarea activităţii desfăşurate la nivel molecular, în cadrul proiectului, de către echipele de lucru de la INCDA Fundulea şi USAMVB (P1).
Întâlnirile au permis realizarea unui schimb util de informaţii şi opinii, în vederea finalizării în bune condiţiuni a etapei, la nivelul celor patru institute partenere.

Activitatea II.5.2: Efectuarea de stagii de documentare/cercetare şi participarea la manifestări ştiinţtifice internaţionale de prestigiu.

Efectuarea de stagii de cercetare şi documentare. În perioada mai-septembrie 2013, trei dintre membrii echipei de lucru au efectuat următoarele deplasări internaţionale, cu scopul de a aprofunda unele aspecte teoretice şi practice legate strict de tematica proiectului şi anume:

1-Stagiul de cercetare la Institutul pentru Biologia Plantelor Zürich(UZH) Elveţia, Dept. Biologie-Fitopatologie moleculară (1-31 mai 2013), având ca obiective: a)Însuşirea metodelor de lucru cu privire la izolarea de ARN, b)obţinerea de ADNc şi evidenţierea expresiei genei Lr34, Delegat: dr. Matilda Ciucă (CO-INCDA Fundulea, colectiv genetică moleculară);

2-Vizită de documentare la INRA-Versailles Grignon-(12EFS, 12-17mai, 2013)-Laboratorul de Fitopatologie, din cadrul Colectivului de Epidemiologie în vederea obţinerii de informaţii detaliate cu privire la: tematica specifică de cercetare, metodologia de lucru şi rezultatele relevante înregistrate privind rezistenţa durabila a grâului la rugina brună. Delegat: dr. Mariana Ittu (INCDA-Fundulea, colectiv ameliorare grâu);

3-Stagiu de documentare la Centrul internaţional pentru porumb şi grâu (CIMMYT) Mexic, în domeniul ameliorării moderne a grâului. ElBatan şi Toluca, Mexic, 13 august-15 septembrie 2013. Delegat: dr. Cristina Marinciu (INCDA-Fundulea, colectiv ameliorare grâu).

Participarea la manifestări ştiinţifice internaţionale. Prof. Petruţa Cornea (USAMVB-P1), a participat între 5-7 iunie 2013, la a 2-a Conferinţă internaţională a USAMV Bucureşti ”Agriculture for life, life for agriculture” cu lucrarea prezentată sub formă de poster, intitulată”Extraction of fungal spores DNA from Puccinia triticina”. Autori: L.D.Dinu, C.P.Cornea şi M.Ciuca, Book of abstracts, p. 33, ISSN 2343-9653.

Concluzii etapa:

• S-au obţinut linii noi de grâu, provenite din încrucişări directe, backcross şi top cross între genele de rezistenţă durabilă slow-rusting şi genotipuri adaptate de grâu, care vor fi analizate în anul 2014 pentru exprimarea acestui tip de rezistenţă şi asocierea cu alte caractere agronomice utile;

• Utilizarea unor markeri moleculari specifici şi funcţionali a evidenţiat genotipurile homozigote pentru fiecare din genele Lr34+ şi Lr46+, sau pentru piramidarea acestora–DuRes116-2013;
  

• Complexitatea şi noutatea abordării moleculare pentru: a)identificarea prezentei genelor de rezistenţă durabilă, Lr 46 şi mai ales Lr67, precum şi a b) polimorfismului virulenţei patogenului, impun aprofundarea în continuare a cercetărilor şi analizarea unui număr mai mare de variante cu metode îmbunătăţite de lucru;

• Ridicarea nivelului de pregătire profesională, prin stagiile de cercetare şi documentare efectuate în domeniul tematicii proiectului, de către trei membrii ai echipei de cercetare în centre internaţionale de prestigiu (UZH Zurich, Elveţia; INRA, Franţa şi CIMMYT, Mexic), precum şi îndeplinirea planului de dotare cu echipamentele necesare, prevăzute pentru aceasta etapă, constituie premise pentru realizarea în bune condiţuni a etapelor următoare de realizare a proiectului,

  
  Pe baza rezultatele obţinute până în prezent au fost elaborate lucrările:
  
  -Extraction of fungal spores DNA from Puccinia triticina. Autori: L.D.Dinu, C.P.Cornea şi M.Ciuca, Volumul de rezumate, a 2-a Conferinţă internaţională a USAMV, 5-7 iunie, 2013, Bucureşti ”Agriculture for life, life for agriculture” p. 33, ISSN 2343-9653;
  
  -Caracterizarea molecularǎ a stării alelice a genei Lr34 în germoplasma româneascǎ de grâu- Simpozionul “Preocupǎri Actuale şi de Perspectivǎ în Genetica Vegetalǎ şi Animalǎ”-Autor: M. Ciucă (20 iunie 2013, Bucureşti, ASAS);
  
  -Evidenţierea molecularǎ a prezenţei genei Lr34, asociatǎ rezistenţei durabile la rugina brunǎ, în germoplasma româneascǎ de grâu. Autor: M. Ciucă (Sesiunea Internă de Referate a INCDA Fundulea, 26 martie 2013).
  
  -Detection of molecular polymorphism of Puccinia triticina from wheat in Romania. Autori: L. D. Dinu, C. Diguta, M. Ciuca, L. Ursu, C. P. Cornea, Scientific Bulletin.Series F. Biotechnologies. ISSN 2285-1364, în curs de evaluare.

REZUMATUL ETAPEI III

Titlul etapei: Evaluarea rezistenţei parţiale de plantă adultă (APR), de tip slow-rusting, la genotipurile de grâu româneşti obţinute în cadrul proiectului-Ciclul 2

Obiective: Caracterizarea germoplasmei originale de grâu cu privire la rezistenţa durabilă faţă de provenienţe româneşti de rugină brună

Echipa de cercetare pentru aceasta etapă a fost alcătuită din:

In cursul etapei III (2014)au fost planificate şi realizate următoarele activităţi:

Activitatea III.1: Analiza fenotipică şi genotipică a diversităţii virulenţeila provenienţele româneşti de P. triticina (set 2012-2014)

Rezultate obţinute Activitatea III.1: Au fost obţinute stocuri noi de spori (urediniospori) şi izolate purificate (monosporale), necesare pentru realizarea lucrărilor planificate de caracterizare fenotipică şi genotipică a virulenţelor ciupercii Puccinia triticina. A fost stabilită formula de virulenţă/avirulenţă, la nouă izolate monopustulare, pe baza tipului de infecţie rezultat din infectarea artificială a unui sortiment diferenţiator alcătuit din 17 gene de rezistenţă la rugina brună R-Lr (Fig. 1).

Fig. 1. Stabilirea formulei de virulenţă/avirulenţă a izolatelor de Puccinia triticina, în funcţie de reacţia de sensibilitate/rezistenţă a unui set de gene de rezistenţă R-Lr diferenţiatoare

Nivelul relativ mai ridicat de virulenţă al populaţiei de rugină brună de la Livada (reacţie de compatibilitate cu 7-9 gene Lr), comparativ cu populaţia prelevată de la Fundulea (1-5 gene compatibile), precum şi unele particularităţi ale provenienţelor Albota, au fost confirmate şi prin analize moleculare, efectuate la USAMVB (Partener 1) cu tehnica RAPD (opt primeri decamerici), urmată de analiza statistică cu programul DendroUPGMA clustering şi cu primeri de tip SSR-PCR (PtSSR 76/92/151A/184), prin separare electroforetică a produşilor de amplificare pe trei tipuri de geluri: a)agaroză convenţională, b)agaroză de tip MetaPhor Lonza şi c)poliacrilamidă.

Activitatea III.2: Evaluarea fenotipică a rezistenţei de plantă adultă (APR) la rugina brună în teste de laborator şi câmp

Rezultate obţinute Activitatea III-2: Un set de 133 linii avansate, (generaţia F3), provenite din 10 combinaţii hibride obţinute la INCDA-Fundulea (Coordonator), a fost analizat în localităţile Fundulea, Livada (Partener 2) şi Albota (Partener 3), pe baza observaţiilor repetate (3-7), privind: procentul de atac (Severitate, %) şi tipul de infecţie (TI: 0R, MR, S,FS), rezultatele fiind calculate statistic, pe baza indicelui sintetic aria sub curba de progres a bolii (AUDPC), specific pentru caracterizarea acestui tip de rezistenţă. Limitele de variaţie şi valorile medii, înregistrate pentru AUDPC, sugerează un nivel de eficacitate relativ ridicat conferit în cazul genei de rezistenţă R-Lr46, în combinaţii, atât cu soiul Miranda (X=172,9), cât şi cu soiul Glosa (X= 208,3).
La Fundulea, au continuat lucrările pentru diversificarea germoplasmei cu rezistenţă de tip slow-rusting la rugina brună şi caracterizarea acestui tip de rezistenţă în condiţii de presiune accentuată de infecţie, în câmp. Au fost obținute şi testate 849 linii descendente-F2, rezultate din combinaţii backcross (F2-BC1) şi testcross (F2-TC), în vederea selecţiei de genotipuri care întrunesc însuşiri de rezistenţă de tip slow-rusting cu însuşiri agronomice îmbunătăţite. Rezultatele obţinute evidenţiază progresul înregistrat cu privire la nivelul de rezistenţă urmărit.

Activitatea III.3: Evaluarea genotipică a rezistenţei de plantă adultă (APR) la rugina brună

Rezultate obţinute-Activitatea III.3. Evidenţierea alelelor genelor Lr34, Lr46 şi Lr67 s-a realizat cu markeri moleculari specifici după parcurgerea etapelor de: a)Izolare ADN genomic din frunze; b)Reacţia de amplificare ADN (PCR); c)Electroforeza produşilor PCR în gel de agarozǎ şi/sau poliacrilamidǎ.
Prezenţa alelelor de rezistenţǎ a genei Lr34 s-a efectuat cu markerul funcţional cssfr5 la un set 245 de linii de grâu originale, aflate în generaţia F3, fiind evidenţiate următoarele stări genotipice: homozigot rezistente (Lr34+): 130 linii; heterozigot rezistente(Lr34+Lr34-): 44; homozigot sensibile (Lr34-): 71.
Pentru evidenţierea genei Lr46, s-a folosit markerul molecular wmc44, care a permis evidenţierea la 224 linii de grâu obţinute din combinaţia Glosa (Lr34+)/Pavon 76 (Lr46+), stările genotipice: homozigot rezistente(Lr46+): 79 linii; heterozigot rezistente(Lr46+Lr46-): 39 linii; homozigot sensibile(Lr46-): 99 linii, produs PCR diferit de cel al sursei pentru gena Lr46 (Pavon76) la două linii şi lipsa amplificării la cinci linii.
Analizele pentru evidenţierea prezenţei alelei de rezistenţǎ a genei Lr67, s-au efectuat cu markerul cfd71 şi evidenţierea produşilor PCR pe gel de poliacrilamidă 6% şi coloraţie cu azotat de argint. Au fost analizate 69 linii originale de grâu-generaţia F3, la care s-au evidenţiat următoarele stări genotipice: homozigot rezistente (Lr67+): 36 linii; heterozigot rezistente (Lr67+Lr67-): 6; homozigot sensibile (Lr67-): 25; produs PCR diferit de cel al sursei pentru gena Lr67: două linii. De asemenea, a fost validată piramidarea alelelor de rezistenţă pentru combinaţiile de gene Lr34/Lr46 la 45 de linii şi respectiv, Lr34/Lr67pentru linia DuRes 271-4, obţinute în cadrul proiectului.

 

 

Activitatea III.4: Stabilirea sortimentului specific de genotipuri-Ciclul 3 şi înfiinţarea câmpului experimental-An III

Rezultate obţinute Activitatea III.4. Pe baza caracterizării fenotipice şi moleculare a liniilor avansate, obţinute în cadrul proiectului, cu privire la rezistenţa de tip slow-rusting, dar şi a unor însuşiri agronomice utile, s-a alcătuit un set de set de 126 linii de perspectivă (F4) pentru ciclul 3 de realizare a proiectului la Fundulea, Livada si Albota, liniile componente fiind selecţionate în funcţie de : a)fenotipul de rezistenţă de tip slow-rusting, b)confirmarea cu markeri moleculari specifici, a prezenţei a două gene R-Lr ţintă în stare homozigotă şi c)însuşiri agronomice corespunzătoare tipului de grâu de toamnă cultivat în România. La Fundulea au fost semănate şi 301 linii F3, descendenţe a 12 combinaţii hibride directe, backcross şi topcross, precum şi 75 linii F2, obţinute din noi combinaţii backcross (6) şi topcross (5).

Activitatea III.5: Participarea la manifestări ştiinţifice de profil:

A-Participări şi contribuţii: În cursul acestei etape membrii ai echipei de cercetare au participat la următoarele manifestări științifice internaționale:

1) EUCARPIA Cereals Section-I.T.M.I. Joint Conference Wernigerode. Cereals for Food, Feed and Fuel-Challenge for Global Improvement. Wernigerode, Germany, June 29-July 4, 2014
Participanţi: Dr. ing. Gheorghe Ittu, dr. Matilda Ciuca si dr. biol. Mariana Ittu-INCDA Fundulea.

Postere prezentate:

-Molecular identification of slow rusting leaf rust resistance genes in the Romanian wheat germplasm. Autori: M. Ciucă, D. Cristina, A. G. Turcu, L. Conțescu. 2014
(http://www.eposters.net/pdfs/molecular-identification-of-slow-rusting-leaf-rust-resistance-genes-in-the-romanian-wheat-germplasm.pdf);

- Phenotypic and molecular approach of durable resistance to leaf rust in wheat. 2014
Autori: Ittu M., M. Ciucă, C. M. Marinciu, G. Ittu
(http://www.eposters.net/poster/phenotypic-and-molecular-approach-of-durable-resistance-to-leaf-rust-in-wheat/ http://plantbreeders.hu/files/book_of_abstracts.pdf);

2) A 11-a  Conferința a Fundației Europene pentru Fitopatologie, intitulată Plante sănătoase-Oameni sănătoși (11th EFPP Conference  Healthy plants—healthy people), organizată de Facultatea de Agronomie din Cracovia (Polonia), între 8-13 September 2014.
Participant: Prof. dr. Petruţa Cornea-USAMVB.

Poster prezentat:
Genetic diversity of Puccinia triticina populations from Romania analysed by RAPD technique.
Autori: L.D. Dinu, C. Diguţa, M. Ciucă, C. P. Cornea.
(http://www.kongres-fitopatologiczny.pl/kongres.php?id=program;http://www.kongres-fitopatologiczny.pl/pliki/Session4_Genomics-proteomics.pdf)

3)Al XIII-lea Simpozion Internațional „Prospectari pentru agricultura mileniului 3 (13th International Symposium”Prospects for the 3rd Millennium Agriculture” Cluj-Napoca, 25th – 27th of September 2014).
Participant: dr. Gabriela Popa –USAMVB.
Poster prezentat:
Genetic diversity of Puccinia triticina populations from Romania analysed by RAPD technique. Autori: L. D. Dinu, C. Diguţa, M. Ciucă, G. Popa, C. P. Cornea. (http://symposium.usamvcluj.ro/Book_of_abstract_1_2014.pdf).

B-Lucrări ştiinţifice- publicate sau acceptate spre publicare în reviste cotate ISI (TAG şi CRC) sau BDI:

1. M. Ciuca, D. Cristina, A.G. Turcu, E.L. Contescu, V. Ionescu and N.N. Saulescu. cereal research communications. Molecular detection of the adult plant leaf rust resistance gene Lr34 in Romanian winter wheat germplasm-Acceptata pentru publicare-Cereal Research Communications-ACCEPTAT July 22-2014 (ISI);

 

2. Dinu L. D., Diguta C., Ciuca M., Ursu L., Cornea C. P. 2014, Detection of molecular polymorphism of Puccinia triticina from wheat in Romania. Scientific Bulletin. Series F. Biotechnologies, Vol. XVIII, ISSN 2285-1364, 15-19 (BDI).
(http://biotechnologyjournal.usamv.ro/index.php/scientific-papers/current)

 

CONCLUZIILE ETAPEI III

٭٭٭ Au fost realizate toate activităţile planificate pentru această  etapă de realizare a proiectului, conform obiectivelor asumate cu privire la:
i)obţinerea de germoplasmă originală de pre-ameliorare cu însușiri de rezistență la rugina brună de tip slow-rusting,
ii)caracterizarea fenotipică şi moleculară a virulenţei patogenului şi a rezistenţei plantei gazdă;
iii)înfiinţarea de dispozitive experimentale noi pentru ciclul de vegetație 2014/2015,
iv)participarea la manifestări ştiinţifice internationale, cu consecinţe benefice în domeniul de informare-documentare de specialitate și al obținerii, prin schimburi cu specialiști străini, a unor surse genetice valoroase de rezistenţă la rugini, necesare pentru ameliorarea grâului şi elaborarea de lucrări ştiinţifice;

٭٭٭ Au fost puse în evidenţă, prin analize moleculare specifice, neutilizate anterior în România, aspecte privind variabilitatea virulenţei în populaţiile de rugină brună, prelevate din localităţile Fundulea, Albota şi Livada;

٭٭٭ Caracterizarea fenotipică şi prin analize moleculare a rezistenţei de tip slow-rusting, a evidenţiat posibilitatea identificării în germoplasma originală, obţinută în cadrul proiectului, a unui număr optim de linii homozigote, pentru fiecare dintre genele ţintă pentru rezistenţă la Puccinia triticina, Lr34, Lr46 şi Lr67 sau combinaţii (piramidări) ale acestora (Lr34/Lr46 si Lr34/Lr67), care va permite extinderea cercetărilor și în direcția asocierii acestui tip de rezistență cu alte  caractere agronomice utile;

٭٭٭ Prin includerea în echipa de cercetare a proiectului, iniţial pe poziţii tehnice, a studenţilor dn anii terminali de studii (USAMVB), Turcu Alina Gabriela și Cristina Daniel, în prezent Asistenți de Cercetare (termen nelimitat) în cadrul colectivului de Genetică Moleculară-INCDA Fundulea, proiectul a contribuit efectiv la atragerea şi calificarea de tineri specialişti pentru activitatea de cercetare;

٭٭٭ Pe baza celor arătate anterior, se consideră că sunt întrunite premisele pentru realizarea etapelor următoare  şi finalizarea proiectului.

 

2015-ETAPA IV

 Titlul etapei: Evaluarea rezistenţei şi a performanţelor agronomice la genotipurile de grâu româneşti selecţionate pentru rezistenţa parţială de plantă adultă (APR), de tip slow-rusting (Ciclul 3).

 În perioada 01.01.2015-30.11.2015, au fost realizate toate obiectivele şi activităţile prevăzute în planul de execuţie a proiectului-Etapa 4, fiind întrunite toate condiţiile pentru continuarea şi finalizarea acestuia la termenul asumat prin contract. Rezultatele obţinute şi concluziile formulate pentru toate activităţile desfăşurate sunt prezentate în continuare.

Activitatea IV.1: Analiza fenotipică şi genotipică a diversităţii virulenţei la provenienţele româneşti de P. triticina obţinute în cadrul proiectului (set 2013-2015).
Analizele moleculare efectuate la USAMVB (Partener 1), cu primeri de tip SSR pentru amplificarea unor fragmente specifice de ADN, izolat din 17 surse de rugină brună, prelevate în perioada 2011-2015 (şase populaţii noi) şi separarea electroforetică a produşilor de amplificare, prin trei tipuri de geluri: agaroză convenţională (pentru evidenţierea prezenţei ADN şi a produşilor de amplificare), agaroză de tip MetaPhor şi poliacrilamidă, au permis detectarea unui polimorfism intra şi inter-populaţional, cele mai clare informaţii fiind cele obţinute cu primerii PtSSR 151A, PtSSR154 şi PtSSR184. Analiza efectuată cu programul dendroUPGMA, atât pentru populaţiile, cât şi pentru izolatele monopustularele derivate, au evidenţiat o tendinţă de grupare a acestora, mai accentuată în raport cu planta gazdă de pe care au fost prelevate, decât de anii de recoltare şi/sau localitatea de provenienţă a acestora. Lucrările de fenotipare executate la INCDAF(Coordonator), cu un sortiment diferenţiator standard, au permis stabilirea formulei de virulenţă/avirulenţă a surselor de rugină brună prelevate şi purificate din populaţii locale de Puccinia triticina. Acestea sugerează o compatibilitate limitată faţă de genele de rezistenţă Lr prezente în actualele soiuri de grâu cultivate.
Rezultatele obţinute în anul 2015 privind variabilitatea virulenţei caracteristică populaţilor locale de Puccinia triticina, analizateîn cadrul proiectului ca o abordare nouă pentru România, cu aplicaţii practice pentru orientarea lucrărilor de ameliorare şi tehnologia de cultivare, sunt în concordanţă cu datele raportate în literatura de specialitate, privind polimorfismul relativ scăzut al acestui patogen, cu impact major global în cultura grâului,

Activitatea IV.2: Evaluarea fenotipică şi genotipică a rezistenţei de plantă adultă (APR), de tip slow-rusting la germoplasma rezultată în cadrul proiectului (ciclul 3).
Lucrările experimentale de genotipare și fenotipare, desfășurate la INCDAF, în cadrul colectivelor de Genetică moleculară și Ameliorarea grâului, precum și cele de fenotipare executate la SCDA Livada  (Partener 2) și SCDA Pitești (Partener 3), au condus la identificarea unui număr important de noi linii homozigote şi heterozigote pentru genele ţintă Lr34 (206-Lr34+), Lr46 (161-Lr46+) şi Lr 67(40-Lr67+). Identificarea în această etapă a noi genotipuri caracterizate prin prezenţa-piramidarea a două astfel de gene, cum sunt: Lr34+/Lr46(N-72), Lr34+/Lr67+(N-7), asigură premise certe pentru continuarea lucrărilor şi realizarea obiectivului final al proiectului.
Totodată, prin lucrările de fenotipare şi genotipare, efectuate cu metode specifice pentru evidenţierea rezistenţei de tip slow-rusting la rugina brună, a fost perfecţionată metodologia de lucru, care va putea fi aplicată în programul de ameliorarea grâului şi pentru alte caractere agronomice utile.

Activitatea IV.3: Analiza însuşirilor agronomice utile la germoplasma selecţionată pentru rezistenţa parţială de plantă adultă (APR), de tip slow-rusting, la rugina brună.
În cadrul etapei au fost realizate pentru prima dată şi lucrări de caracterizare a unor însuşiri agronomice utile de productivitate şi calitate a germoplasmei originale,aflate în generaţiile F3 şi F4, obţinute în cadrul proiectului. Lucrările efectuate în principal la INCDAF, în cadrul colectivelor de Ameliorarea grâului și Genetică moleculară, au demonstrat existenţa asocierii dintre performanţele de producţie, calitate şi adaptabilitate, fiind identificate prin selecţie asistată de markeri moleculari, 41 de linii de pre-ameliorare, purtătoare ale uneia sau a două gene de rezistenţă la rugina brună, LrR de tip slow-rusting, cu perspective de a fi utilizate pentru diseminare, în programele de ameliorarea grâului din România, precum şi pentru piramidare, în soiurile de perspectivă. În etapa următoare se vor continua testările acestor linii, sub aspectul performanţelor menţionate anterior, cu posibilitatea de a le utiliza ca genitori sau dacă este cazul,  pentru omologare.

Activitatea IV.4: Stabilirea sortimentului specific de genotipuri-Ciclul 4 şi înfiinţarea câmpului experimental-An IV.
Dispozitivele experimentale 2015/2016, incluzând între 200-1000 variante selecţionate pe baza criteriilor complexe de apreciere fenotipică şi genotipică descrise anterior, s-au înfiinţat în perioada şi în condiţii optime pentru cultura grâului, în centrele experimentale Fundulea (irigat şi neirigat), Livada şi Albota.

Componenţa dispozitivelor experimentale–An IV (2015/2016), înfiinţate în toamna anului 2015, în trei localităţi.

Componenţa dispozitivelor experimentale	Numărul de linii
	Coordonator- Fundulea, jud. Călăraşi (nr. linii)	P2- SCDA Livada, jud. Satu-Mare (nr. linii)	P3- SCDA Albota, jud. Argeş (nr. linii)
Data înfiinţării	5.10.2015-neirigat 19.10.2015-irigat	15.10.2015	1.11.2015
1-Linii F4-irigat	159
1-Linii F4-neirigat	136	136	136
		-	-
2-Linii F3 & F2	425	-	-
Total linii	720	136	136
Total variante (linii recombinante, părinţi & spreaderi S)	1000	200	200

 

Activitatea IV.5: Participarea la manifestări ştiinţifice de profil
În anul 2015, membrii echipei de realizare a proiectului de la INCDAFundulea (Coordonator), au contribuit la diseminarea rezultatelor obţinute, prin contribuţii orale şi sub formă de postere la manifestări ştiinţifice de profil, organizate la nivel naţional şi internaţional şi prin articole publicate sau în curs de apariţie sau evaluare în reviste de specialitate, indexate în baze internaţionale de date:

A.Participare la manifestări naţionale:
A.1) Sesiunea internă de referate a INCDAFundulea -17.02.2015
-Prezentare orală:         -i) Evidenţierea molecularǎ a prezenţei genelor de rezistenţǎ la rugina brunǎ Lr34, Lr46, Lr67, Lr68 şi Lr37 în germoplasma de grâu. Autori: D. Cristina, A. G.Turcu, L. Conţescu, Ionescu V. şi M. Ciucă.
A.2) Sesiunea anuală de referate a INCDAFundulea, ASAS-Bucureşti, 08.05.2015
-Prezentare orală:     -ii)Situaţia actuală a folosirii markerilor moleculari în programul de ameliorarea  grâului de la INCDA. Autori: M. Ciucă, D. Cristina, A. G.Turcu, L. Conţescu, V. Ionescu.
-Prezentare postere:     -iii)Evidenţierea moleculară a transferului şi cumulării genelor de rezistenţă la rugina brună Lr34, Lr46, Lr67 în germoplasma de grâu. Autori: D. Cristina, A. G.Turcu, L. Conţescu, V. Ionescu V. şi M. Ciucă.
-iv)Caracterizarea fenotipică a rezistenţei de tip slow-rusting la linii de grâu derivate din combinaţii cu genele de rezistenţă Lr34, Lr46 şi Lr67. Autori:Ittu M., Marinciu C. M., Bănăţeanu C., Voica M. şi Ittu G.

B.Participare la manifestări internaţionale

-EWAC-The European Cereals Genetics Co-operative EUCARPIA Cereals Section International Conference, Lublin, Polonia, 25.05.-29.05.2015, organizată de către Institutul de Genetica plantelor, ameliorare şi biotehnologie-Universitatea pentru Ştiinţele vieţii (Institute of Plant Genetics, Breeding and Biotechnology, University of Life Sciences). Participant: dr. Matilda Ciucă a prezentat oral în cadrul Sesiunii 3-Trait Evaluation and Genetic Mapping, lucrarea intitulată: Molecular approach to validate the transfer of APR-Lr genes into Romanian adapted wheat genotypes. Autori: Ciucă M., Cristina D., Turcu A. G., Conţescu L., Marinciu C. M. şi Ittu M. http://www.ewac.eu/docs/EWAC_2015_Abstracts.pdf. Lucrarea este în prezent în curs de evaluare și pentru publicare in extenso în volumul de lucrări al conferinței (Proceedings of Conference).

-ST26733”, International Conference "Agriculture for Life, Life for Agriculture, USAMVB Bucuresti, 04-06.06.2015. A participat Daniel Cristina. Contribuţia , sub formă de poster, în cadrul sesiunii Agricultural Biotehnology, s-a intitulat: Molecular Detection of Resistance Genes to Leaf Rust Lr34 And Lr37 in Wheat Germplasm. Autori: Daniel Cristina, Alina Gabriela Turcu şi Matilda Ciucă. Lucrarea a fost publicată in extenso în volumul Agriculture and Agricultural Science Procedia, vol. 6, 2015, pag. 533–537, ISSN 2210-7843. Prezentarea a fost premiată de către Comitetul ştiinţific, cu premiul Best Poster-în cadrul sesiunii Agricultural Biotehnology al manifestării științifice.

Articole ştiinţifice
-Publicate:
1)Molecular detection of the adult plant leaf rust resistance gene Lr34 in Romanian winter wheat germplasm. Autori: M. Ciucă, D. Cristina, A. G.Turcu, L. Conţescu, Ionescu V. şi N.N. Săulescu, acceptată pentru publicare în anul 2014, a fost publicată în 2015 în Cereal Research Communications (doi: 10.1556/CRC.2014.0040; ISSN: 0133-3720), vol. 43 (2): 249-259 (FI=0,624; Scor relativ de influenta=0,273);
2) Molecular detection of resistance genes to leaf rust Lr34 and Lr37 in wheat germplasm. Autori: D. Cristina, A.G. Turcu, M. Ciucă. Agriculture and Agricultural Science Procedia, ISSN: 2210-7843, vol. 6: 533-537(doi: 10.1016/j.aaspro.2015.08.080);

-Acceptate pentru publicare în anul 2016 (Scrisoare de acceptare RBL-Editorial Board, 10.11.2015):
3)Genetic diversity of Puccinia triticina populations from Romania analysed by RAPD technique. Autori: Dinu L. D., Ciucă M., Cornea P.-Romanian Biotechnological Letters-(cotată ISI, ISSN: 1224-5984, FI: 0,404, Scor de influenţă: 0,091).

Alte rezultate

Contribuţia proiectului la atragerea tinerilor şi formarea profesională pentru activitatea de cercetare, s-a concretizat, prin faptul că Daniel Cristina şi Alina Gabriela Turcu, având vârste sub 35 ani, cooptaţi în echipa de lucru a proiectului, încă din anul 2012, când se aflau în anii terminali de studii universitare la Facultatea de Biotehnologii, USAMVB, au absolvit în luna iulie 2015 şi studiile masterale, cu lucrări de dizertaţie în domeniul Aplicaţii moderne ale biotehnologiilor în agricultură, bazate pe tematica proiectului, Coordonator ştiinţific: Prof.univ.dr. Petruţa Călina CORNEA şi Îndrumător ştiinţific: Dr. Matilda CIUCĂ. În prezent, ambii ocupă poziţii permanente, de asistenţi de cercetare(AsC),, în cadrul colectivului de Genetică moleculară, Institutul Naţional de Cercetare-Dezvoltare Agricolă Fundulea (INCDAF) şi fac parte din echipa de realizare a proiectului.

Titlurile lucrărilor lor de dizertaţie sunt următoarele:

-Daniel Cristina: Abordări moleculare pentru validarea transferului de gene Lr-APR în genotipuri de grâu adaptate. Facultatea de Biotehnologii, USAMVB,iulie 2015.

-Alina Gabriela Turcu: Detectarea moleculară a genelor de rezistenţă la rugina brună Lr34 şi Lr67 în germoplasmă de grâu. Facultatea de Biotehnologii, USAMVB, iulie 2015.

 

 

 

Etapa V-2016-Trimestrul 1 (ianuarie-martie)

Denumirea etapei: Validarea rezultatelor privind diversitatea virulenței unor proveniențe de Puccinia triticina și a asocierii dintre rezistența durabilă, de tip slow-rusting la rugina brună și alte însușiri agronomice utile, în germoplasma de grâu obținută în cadrul proiectului.

Activitatea V.1: Validarea rezultatelor privind diversitatea izolatelor de Puccinia triticina analizate la nivel molecular.
Rezultate estimate: Validarea rezultatelor obținute la izolatele patogene selecționate

Sunt în curs de multiplicare și purificare noi izolate de P. triticina (INCDA Fundulea), extrase din populațiile patogene locale obținute în anul 2015, precum și cele deja existente în stocurile realizate în etapele anterioare (USAMVB-P1), în vederea validării la nivel molecular a rezultatelor privind diversitatea virulenței patogenului în condițiile analizate.

Activitatea V.2: Stabilirea sortimentului specific de linii avansate-Ciclul 5, cu rezistenţă de tip slow-rusting, de plantă adultă (APR), validată la nivel fenotipic și molecular şi însuşiri agronomice îmbunătăţite.
Rezultate estimate: Validarea prezenței genei(lor) țintă la genotipurile selecționate

În vederea obținerii de ADN necesar realizării acestui obiectiv, au fost recoltate la sfârșitul lunii martie, 645 probe de frunze de la liniile F4, F3 si F2, rezultate din combinații directe, backcross și topcross, efectuate între sursele de rezistență luate în studiu (genele de rezistență de plantă adultă Lr34, Lr46 și Lr67) și linii adaptate de grâu, precum și de la părinții acestora, aflate în câmpurile experimentale înființate în toamna anului 2015 la INCDA Fundulea (Coordonator proiect). Pentru analiza ADN, în cadrul colectivului de genetică moleculară din acest institut, vor fi utilizate metode specifice de extracție și markeri moleculari asociați genelor respective.

Rezultate estimate: Evidențierea la germoplasma originală obținută, a asocierii dintre rezistenţa de plantă adultă (APR), de tip slow-rusting şi alți indicatori agronomici utili
 
Liniile originale obținute în cadrul proiectului au fost caracterizate în această etapă la INCDA Fundulea (CO), SCDA Livada (P2) și SCDA Pitești (P3), cu privire la tipul agronomic,  urmând ca observațiile ulterioare pentru alte caractere agronomice (precocitatea, talia și calitatea de panificație) și de rezistență de tip slow-rusting la rugina brună, să fie efectuate numai la liniile selecționate pentru tipul de toamnă, specific condițiilor de cultura grâului din România (>50% din totalul liniilor analizate).
La Fundulea s-au realizat între 18.02-31.03.2016, în toate parcelele experimentale, 16 cicluri de inoculări artificiale și plantări de plante infectate (spreaderi) cu Puccinia triticina, pentru asigurarea nivelului optim de testare și evaluare fenotipică a rezistenței, în condiții de câmp (Fig. 1).

Fig. 1. Infecție artificială cu rugină brună, în condiții de câmp (Fundulea, martie 2016)

Trebuie menționat că de la înființarea culturilor în octombie 2015, cu precădere în primăvara anului 2016, în toate localitățile experimentale, temperaturile și regimul de precipitații s-au  abatut semnificativ, de la mediile multianuale pentru aceasta perioadă.
Astfel, la Fundulea s-au  înregistrat valori mai mici de temperatură cu 1,9 C°, față de mediile multianuale, în luna ianuarie, în timp ce în lunile februarie și martie au fost cu 2.6-9,1 C° mai mari. În contrast, suma precipitațiilor a fost deficitară la începutul perioadei de inoculare artificială (luna februarie 2016)(Tabelul 1), ceea ce poate influența într-o oarecare măsură evoluția atacului, deși ulterior, în urma îmbunătățirii acestuia, procesul a fost inițiat, fapt atestat de apariția primelor pustule de rugină brună pe plantele spreader.

Tabel 1. Temperatura medie (C°) și suma precipitațiilor (mm)

 

Activitatea V.3: Participarea la manifestări ştiinţifice de profil
Rezultate estimate:
- întocmirea de articole științifice pe baza rezultatelor obţinute în cadrul proiectului și promovarea acestora;
-actualizarea cunoştinţelor ştiinţifice şi a contactelor cu specialiştii străini în domeniul de referinţă.

Pe baza rezultatelor obținute în cadrul proiectului, a fost întocmită lucrarea științifică Evaluation of response to leaf and stripe rusts in Romanian winter wheat and triticale germplasm. Autori: Ittu Gheorghe and Mariana Ittu, care va fi prezentată sub forma de poster la cel de-al 9-lea Simpozion Internațional Triticale, care va avea loc la Szeged, Ungaria. De asemenea, în perioada 24-26 mai 2016, este planificată efectuarea unei vizite de documentare la Cereal Research non-profit Ltd, Szeged, Ungaria, privind preocupările actuale și rezultatele obținute în domeniul rezistenței grâului la boli, de către specialiști din acest institut, recunoscuți pe plan internațional.

 

 

 

 

 

Etapa V-2016 FINAL: Validarea rezultatelor privind diversitatea virulenţei unor provenienţe de Puccinia triticina şi a asocierii dintre rezistenţa durabilã, de tip slow-rusting la rugina brună şi alte însuşiri agronomice utile,  în germoplasma de grâu obţinută în cadrul proiectului
REZUMATUL ETAPEI
În perioada 01.01.2016-30.11.2016, au fost realizate toate activităţile  prevăzute în planul de execuţie a etapei finale a proiectului, privind validarea obținerii unei germoplasme originale de grâu, în faza de pre-ameliorare, cu rezistență durabilă de plană adultă la rugina brună și alte insușiri agronomice asociate, pentru a fi valorificate în programele autohtone de ameliorarea grâului.

Nr.	Activitățile efectuate:	Participant:
V.1:	Validarea rezultatelor privind diversitatea izolatelor de Puccinia triticina analizate la nivel molecular	USAMVB -Partener 1
V.2:	Stabilirea sortimentului specific de linii avansate-Ciclul 5, cu rezistenţă de tip slow-rusting, de plantã adultã (APR), validatã la nivel fenotipic şi molecular şi însuşiri agronomice îmbunãtãţite	INCDAF-Coordonator SCDA-Livada-P2 SCDA-Pitești-P3
V.3:	Participarea la manifestãri ştiinţifice de profil	INCDAF-Coordonator USAMVB-Partener 1
V.4:	Infiinţarea câmpului experimental-An V, cu liniile de pre-ameliorare, obţinute în cadrul proiectului	INCDAF-Coordonator

 

Rezultatele obținute:
Activitatea V.1: Validarea rezultatelor privind diversitatea izolatelor de Puccinia triticina analizate la nivel molecular. Studiul polimorfismului molecular la  materialul fungic,  prelevat în anii 2015/2016 și anterior de către Coordonatorul proiectului și Partenerii 2 și 3, din zonele Fundulea, Albota-Pitești (jud. Argeș) și Livada (jud. Satu-Mare), s-a efectuat prin tehnicile RAPD și SSR-PCR, cu ajutorul primerilor decamerici UBC 517, 519, 538 și 556  și a primerilor PtSSR 151A/154/184/186 , care anterior au evidențiat diferențieri intra și inter- populaționale la  probele de Puccinia triticina analizate. Rezultatele obținute în cadrul acestei etape au confirmat eficiența
metodelor de lucru stabilite și optimizate pe parcursul etapelor anterioare, s-au dovedit eficiente pentru analiza moleculară a populațiilor și izolatelor monopustulare de P.triticina  prelevate din zona Albota, Fundulea sau Livada.
Materialul biologic prelevat  în anul 2016 precum și o parte a materialului obținut în anul 2015 au evidențiat ca și în anii anteriori un nivel relativ scăzut de variabilitate a a populațiilor și izolatelor monopustulare analizate, fapt raportat în general și pentru colecții internaționale ale patogenului. Concordanța între tehnicile moleculare folosite (RAPD și SSR)  a fost în general bună. Analiza cu programul dendroUPGMA a datelor obținute cu tehnica RAPD a permis construirea unor dendrograme care evidențiază trei clustere diferite ce grupează populațiile de P.triticina recoltate din zona Albota, Fundulea sau Livada. Cele mai mari diferențe la nivel molecular au fost observate la populațiile recoltate din zona Albota, o grupare similară fiind evidențiată și prin tehnica SSR. În cadrul aceleași populații, diferențele moleculare între  izolatele monopustulare au fost reduse și pot fi interpretate ca fiind determinate de diferențele zonale dintre populațiile locale de origine.

Activitatea V.2:
Stabilirea sortimentului specific de linii avansate-Ciclul 5, cu rezistenţă de tip slow-rusting, de plantã adultã (APR), validatã la nivel fenotipic şi molecular şi însuşiri agronomice îmbunãtãţite.

Obiectivele analizelor moleculare şi de caracterizare fenotipică intreprinse în câmp şi laborator în această etapă, au urmărit la germoplasma originală  rezultată încadrul proiectului: a)validarea prezenţei genei(lor) care conferărezistenţa parţială, de plantă adultă durabilă, de tip slow-rusting la rugina brunăşi a fenotipului corespunzător pentru acest caracter, precum şi b)asocierea cu alte însuşiri agronomice utile ca: rezistenţa la alte boli, tipul agronomic şi calitatea de panificaţie.
 Echipa de genetică moleculară de la INCDA Fundulea (Coordonator) a efectuat analize moleculare la peste 600 de linii obținute în cadrul proiectului, fiind realizate, cu metodele convenționale PCR, etapele specifice de izolare ADN din frunze și/sau semințe, amplificare ADN  și Elctroforeza. Trebuie menționat că în această etapă, pentru izolarea ADN s-au utilizat pentru prima dată și semințe de la plante din generația F5 (tehnica SDS), iar protocolul de lucru privind utilizarea noului marker molecular, asociat genei APR-Lr67, a fost optimizat semnificativ pentru evidențierea clară a produșilor de amplificare specifici acesteia, pe baza informațiilor obținute, personal de la autorul acestuia, Dr. Evans Lagudah, CSIRO Australia, personalitate recunoscută pe plan internțional în acest domeniu.
Analizele moleculare aplicate pentru fiecare dintre genotipurile analizate cu markerii moleculari specifici,  a permis identificarea stării genotipice a genelor țintă Lr34, Lr46 și Lr67 și a combinațiilor dintre acestea. Astfel, prin utilizarea markerului molecular cssfr5, s-au identificat 298 linii homozigote pentru alela de rezistențǎ a genei Lr34 (Lr34+) din totalul de 481 linii analizate. Analiza molecularǎ efectuatǎ cu markerul CAPS-csLV46/TaqI, a evidențiat 245 linii homozigote pentru alela de rezistențǎ a genei Lr46 (Lr46+), din totalul de 304 linii analizate. În ceea ce privește gena Lr67, utilizarea markerului molecular asociat acesteia la un sortiment de 206 linii de grâu descendente ale combinațiilor dintre soiurile adaptate și sursa RL6077, obținută din Canada de la autor (Hiebert, 2010), a evidențiat 31 linii homozigote pentru alela de rezistențǎ a genei Lr67(Lr67+)(Tabelul 1).
Trebuie subliniat că identificarea în germoplasma originală de pre-ameliorare a unui număr de 159 linii grâu, la care analizele moleculare, au atestat cumularea de alele de rezistență, aparținând la câte două gene de tip slow-rusting din cele trei utilizate, reprezintă un rezultat important al proiectului. Dintre acestea, 152 de genotipuri, derivate din combinațiile Pavon76/Glosa și Pavon76/Glosa/Miranda, prezintă piramidarea alelelor de rezistențăLr34și Lr46, în timp ce la alte șapte, s-a identificat piramidarea alelelor de rezistență Lr34 și Lr67 (combinația Lr67/Glosa).

 

Tabelul 1. Validarea la nivel molecular a prezenţei genelor de rezistență la rugina brună Lr34, Lr46 și Lr67,  în germoplasma de pre-ameliorare rezultată în cadrul proiectului (2016)

1-Gena Lr34

Combinația	T	Starea genotipică
		Lr34+	lr34-	H
Lr34/Miranda	46	15	22	9
Lr34/Glosa/Miranda	38	17	10	11
Lr46/Glosa	221	174	39	8
Lr46/Glosa/Miranda	18	17	0	1
Lr67/Glosa	103	58	32	13
Lr67/Glosa/Miranda	27	6	10	11
Lr67/Miranda/ Boema	28	11	3	14
Total	481	298	116	67

 

2-Gena Lr46

Combinația	T	Starea genotipică
		Lr46+	lr46-	H	Lr34+/Lr46+
Lr46/Miranda	65	63	1	1	-
Lr46/Glosa	221	178	37	6	148
Lr46/Glosa/Miranda	18	4	14	0	4
Total	304	245	52	7	152

 

3-Gena Lr67

Combinația	T	Starea genotipică
		Lr67+	lr67-	H	Lr67+/Lr34+
Lr67/Miranda	48	12	36	0	-
Lr67/Glosa	103	19	82	2	7
Lr67/Glosa/Miranda	27	0	27	0	0
Total	178	31	172	3	7

 

- Pentru evidențierea la germoplasma originală obținută, a asocierii dintre rezistenţa de plantã adultã (APR), de tip slow-rusting şi alți indicatori agronomici utili, cercetările au fost orientate în direcţia caracterizării fenotipice a rezistenţei la rugina brună (Puccinia triticina) şi fuzarioza spicului (Fusarium sp.) şi evaluarea principalilor parametrii de calitate.

Caracterizarea fenotipică a rezistenţei de tip slow-rusting la rugina brună. Lucrările de testare pentru rugina brună, s-au efectuat în perioada aprilie-iunie 2016, la Fundulea, Albota şi Livada, în câmpuri de infecţie artificială special organizate pentru testarea rezistenţei de tip slow-rusting: alternanţă rânduri de spreader/linii de ameliorare. O caracteristică a acestui an a fost apariţia în toate centrele experimentale ale proiectului, ca şi în alte zone de cultura grâului din ţară şi din Europa, a unui atac sever de rugină galbenă (Puccinia striiformis),care precedând seria de infecţii artificiale cu P. triticina, a făcut mult mai dificilă decât în anii anteriori, dezvoltarea simptomelor acestei boli, precum şi efectuarea observaţiilor. Nivelul de rezistenţă a fost exprimat pe baza Ariei sub curba de progres a bolii (AUDPC) şi a Ariei relative sub curba de progres a bolii (RAUDPC),care furnizează informaţii privind rezistenţade tip slow-rusting în valori absolute (% din Spreader), precum şi raportate la nivelul local de atac(RADPC). Valorile pentru ambele criterii de apreciere a tipului de rezistenţă urmărit, au variat în limite largi (AUDPC: 272-716) şi (RAUDPC: 33,7-79,7). În condiţiile anului 2016 s-a remarcat în mod special combinaţia Lr67/Glosa(F5), la care s-au înregistrat în medie pe şapte linii, cele mai mici valori ale ambilor parametrii analizaţi, dar și la 105 si respectiv 18 linii din populațiile Lr46/Glosa(F5) și  Lr67/Glosa(F4), valorile medii înregistrate indică un nivel ridicat de rezistență durabilă la rugina brună.

Caracterizarea fenotipică a rezistenţei la fuzarioza spicului. Fuzarioza spicului (Fusarium graminearum şi F. culmorum), reprezintă alături de rugini, una dintre cele mai răspândite și păgubitoare boli cunoscute la grâu, care afectează atât capacitatea de producţie, cât şi calitatea seminţelor. 80 de linii descendente din combinaţiile Lr46/Glosa, Lr67/Glosa, Lr46/Miranda, Lr67/Glosa, Lr 34/Glosa/Miranda şiLr67/Glosa/Miranda şi părinţii acestora au fost caracterizaţi pentru rezistența la acest patogen, în condiţii de infecţie artificială realizate în câmp, prin injectarea inoculului direct în spic.  Rezultatele obținute pe baza evaluării % de semințe fuzariate, AUDPC și greutatea relativă a spicelor inoculate, % din martorul neinoculat, au permis identificarea  unor genotipuri cu nivel optim de rezistență. Valori minime ale AUDPC, cuprinse între 107,3-126,9, s-au înregistrat la linii descendente din combinaţiile Lr46/Miranda, Lr46 şi Lr67/Glosa. Valorile înregistrate pentru greutatea relativă a spicelor cuprinse între 91,1(Lr34/Glosa/Miranda)-100,0(Lr46/Glosa) faţă de martor, sugerează nivelul ridicat de toleranţă al genotipurilor respective. Trebuie menţionat că aceste rezultate pot fi considerate promiţătoare din perspectiva combinării rezistenţei la ambii patogeni, Puccinia triticina şi Fusarium culmorum, abordaţi în cadrul proiectului, dar bineînţeles pentru confirmare, se impune continuarea lucrărilor specifice de testare.

Evaluarea parametrilor de calitate. Au fost analizaţi cu analizorul Infratec1241 (Foss), următoarele caracteristici de calitate: procentul şi calitatea proteinelor(conținutul de gluten umed, indicele de sedimentare Zeleny, tăria aluatului după frământare–W și tăria bobului) la 126 de linii obţinute în cadrul proiectului şi părinţii acestora. Conţinutul de proteine a avut o amplitudine de variaţie foarte mare, de la 11,6% la 19,5%, valoarea medie fiind de 14,97%, care poate fi caracterizată de nivel ridicat, conform standardelor actuale de panificație (12-13%). Procentul ridicat de proteine înregistrat la majoritatea genotipurilor testate, se datorează, în parte și modului de semănat la distanţa de 30cm între rânduri, ceea ce presupune un spaţiu de nutriţie mult mai mare faţă de semănatul normal(rânduri dese). Dintre parametrii care exprimă calitatea proteinelor, conținutul de gluten umed a variat de la 24,6% la 49,9%, cu o valoare medie de 36,8%, valoare superioară faţă de standardul de 24%. Indicele de sedimentare Zeleny a avut o amplitudine de variație foarte mare, de la 26,3ml la 79,3ml, cu o valoare medie de 53,66ml. Valorile pentru tăria aluatului, exprimată prin W, au variat de asemenea, în limite foarte largi, respectiv de la 79 la 344, cu o valoarea medie de 204,6, care depăşeşte valoarea standard (W-200). Tăria bobului a variat de la 11,2 la 75,1, valoarea medie pentru tăria bobului, fiind de 45,85. Pe baza acestor analize se poate afirma că sunt premise pentru selecţia unor genotipuri care recombină principalele caracteristici de calitate ale părinţilor adaptaţi utilizati ca recurenţi pentru transferul genelor de rezistenţă slow-rusting.

Activitatea V.3: Participarea la manifestãri ştiinţifice de profil
În cursul anului 2016-etapa V, trei membrii ai echipei de realizare a proiectului au efectuat deplasări în străinătate pentru participarea la manifestări științifice internaționale, rezultatele scontate fiind: -întocmirea de articole științifice pe baza rezultatelor obţinute în cadrul proiectului și promovarea acestora; -actualizarea cunoştinţelor ştiinţifice şi a contactelor cu specialiştii strãini în domeniul de referinţã.
Deplasările au fost efectuat de către următorii membrii ai echipei:
-Ittu Mariana-Vizită de documentare la Institutul de Cercetări pentru Cereale (Cereal Research non-profit Ltd), Szeged, Ungaria,  23-25.05.2016. Deplasarea s-a efectuat în baza invitației primite din partea institutului gazdă și a avut drept scop obținerea de informații privind rezistența grâului la patogenii majori, respectiv rugini și fuzarioza spicului. Aceste obiective de cercetare sunt abordate curent în cadrul programului de ameliorarea grâului de la INCDA Fundulea și reprezintă totodată, tematica prezentului proiect de cercetare. Deplasarea a fost precedată de un schimb de material biologic, urmând ca rezultatele obținute la Szeged  la nivel molecular, cu privire la postularea unor gene de rezistență la rugina brună, să fie analizate comparativ pentru genotipurile obținute în ambele țări. Programul vizitei a constat din întîlniri cu membrii colectivelor de Genetică moleculară și Rezistență la factorii biotici de mediu, vizitarea laboratoarelor și a experiențelor aflate în derulare în sera și câmpurile institutului de testarea rezistenței la rugini, făinare și fuzarioza spicelor. În concluzie, se poate afirma că prin realizarea acestei vizite de documentare s-au obținut  informații utile  privind stadiul actual de dezvoltare a institutului vizitat, în domeniul specific de cercetare și în perspectiva continuării relațiilor tradiționale de colaborare cu specialiștii unguri;
-Voaideș Mihaela Cătălina-Participare la Congresul European de Biotehnologie (European Biotechnology Congress) 2016, Riga, Letonia între 04-08.05.2016, unde a fost prezentat posterul intitulat Genetic variability analysis of Romanian local populations of Puccinia triticina using SSR-PCR technique. Autori: Dinu Laura Dorina, Voaideș Mihaela Cătălina, Ciucă Matilda și Cornea Petruța Călina.  Book of Abstracts European Biotechnology Congress, 2016, Journal of Biotechnology, Volume 231, Supplement, 10 August 2016;
-Ittu Gheorghe-Participare la al IX-lea Simpozion Internațional Triticale (9th International Triticale Symposium) unde a fost prezentat posterul intitulat Evaluation of response to leaf and stripe rusts in Romanian winter wheat and triticale germplasm. Autori: Ittu Gheorghe și Ittu Mariana, Book of Abstracts, p 34.

Activitatea V.4: Infiinţarea câmpului experimental-An V, cu liniile de pre-ameliorare, obţinute în cadrul proiectului

Pe baza testării complexe a rezistenței la rugina brună, la nivel fenotipic și molecular și a unor însușiri agronomice utile la materialul original obținut în cadrul proiectului, a fost alcătuit un sortiment de linii selecţionate F2-5, care au fost valorificate în această etapă, după cum urmează: i)linii avansate din generaţiile F4-5, în programele autohtone de ameliorarea grâului, aflate în derulare la INCDA Fundulea (Institut coordonator) şi pentru transfer tehnologic, independent de participarea la realizarea proiectului, la SCDA-Piteşti(Partener 3), SCDA Lovrin, SCDA-Turda, şi SCDA-Şimnic, precum şi pentru ii)înfiinţarea câmpului experimental-Anul V-ciclul de vegetaţie 2016/2017, în componenţa căruia au intrat genotipuri în generaţiile F2-4, la care trebuie continuat procesul de ameliorare. Transferul tehnologic s-a realizat pe bază de Proces verbal de predare-primire și Acord de transfer material pentru 15 linii denumite FRB(Fundulea Rugina Brună) (Tabelul 2 și 3), la care s-a obţinut în mare măsură şi recuperarea tipului agronomic pentru o serie de caracteristici de adaptabilitate(rezistenţa la iernare, precocitate şi talia scurtă a plantei), productivitate(tipul agronomic şi umplerea bobului) şi calitate(conţinut de proteine, indice de sedimentare zeleny şi conţinutul de gluten umed).

Tabelul 2. Numărul și data proceselor-verbale de predare-primire pentru  15 linii F4-5, purtătoare a una sau două gene de rezistență durabilă, de plantă adultă de tip slow-rusting, obținute în cadrul proiectului la patru centre de ameliorarea grâului (septembrie, 2016)

 

Partener PCCA99/2012	Centrul de ameliorare	PV predare-primire, dată nr.
Partener 3	SCDA-Piteşti	nr.599/28.09.2016
-	SCDA-Turda	nr. 1009/07.09.2016
-	SCDA-Lovrin	nr. 362/08.11.2016
-	SCDA-Şimnic	nr. 3234/29.09.2016

 

Tabelul 3. Liniile de pre-ameliorare de grâu de toamnă rezultate în cadrul proiectului care au fost transferate la programele de ameliorare de la Fundulea, Turda, Șimnic și Pitești pentru continuarea lucrărilor de ameliorare-Ciclul 2016/2017.

*Transfer tehnologic la SCDA: Piteşti, Turda, Lovrin şi Şimnic, **INCDA Fundulea 

La INCDA Fundulea, nouă linii (F5) au fost introduse direct în compartimentul: a-Genitori-Ciclul 2016/2017(tabelul 3), iar pentru 253 linii F2-F4, reprezentând descendenţe selecţionate din cele 16 combinaţii simple, top-cross şi back-cross realizate, s-a înfiinţat: b-un nou dispozitiv experimental (13.10.2016). Înfiinţarea acestuia a fost determinată de necesitatea continuării post-proiect, a lucrărilor de testare a rezistenţei de tip slow-rusting la rugina brună în condiţii de infecţie artificială, la liniile segregante, printre care se numără şi linii rezultate din combinaţii, dintre soiurile adaptate româneşti Glosa, Miranda, Pajura, cu Sujata (sursă nouă pentru gena Lr67, obţinută în anul 2015 de la Banca de gene-CIMMYT Mexic). Câmpul experimental a inclus şi 48 rânduri de genitori ai combinaţiilor realizate în cadrul proiectului (Tabelul 4).

 

 

CONCLUZII

În perioada 01.01.2016-30.11.2016, au fost realizate toate activitățile și obiectivele asumate din planul de execuţie a etapei finale a proiectului, rezultatele obținute, fiind cele scontate:
- validarea la nivel molecular a obținerii unei germoplasme originale de grâu, în faza de pre-ameliorare, cu fenotip de rezistență durabilă de plană adultă la rugina brună, conferită de genele țintă APR, tip slow-rusting, Lr34(N=298), Lr46(N=298), și Lr67 (N=298);
-identificarea a152 de genotipuri, derivate din combinațiile Pavon76/Glosa și Pavon76/Glosa/Miranda, care prezintă piramidarea alelelor de rezistență Lr34 și Lr46, în timp ce la alte șapte, s-a identificat piramidarea alelelor de rezistență Lr34 și Lr67 (combinația Lr67/Glosa).
-recuperarea tipului agronomic dorit și combinarea rezistenței la rugina brună și fuzarioza spicului cu valori ridicate ale principalilor indici de calitate;
- valorificarea liniilor de pre-ameliorare obținute în cadrul proiectului,  în programul  de ameliorarea grâului de la INCDA Fundulea (nouă linii F5) și înființarea unui nou dispozitiv experimental pentru continuarea lucrărilor de ameliorare (253 linii F2-4)-Ciclul 2016/2017.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Title of the project:

Phenotypic and molecular approaches to develop durable adult plant (slow-rusting, race non-specific) resistance to leaf rust (Puccinia triticina) in wheat (Triticum aestivum)

Acronym: DuRes.

Duration: 2012-2015

Participants:
Coordinator: National Agricultural Research Development Institute Fundulea;
Partner 1: University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, Bucharest;
Partner 2: Agricultural Research Development Station-Livada;
Partner 3: Agricultural Research Development Station-Pitesti.

Abstract

The aim of this project is to develop adult plant, slow-rusting, race-non specific resistance to leaf rust in the Romanian pre-breeding germplasm, in order to accelerate the release in production of new wheat cultivars that combine durable resistance type and agronomic traits.

The main objectives of the present collaborative project are the following:

• to analyse the diversity of local Puccinia triticina population by a)inoculation of differentials in seedling stage and on detached leaf fragments (Arraiano et al., 2001) and b)DNA analysis;

• to characterize the slow-rusting phenotypic expression of resistance to leaf rust in seedling (artificial inoculation) and adult stage (artificial and natural infection);

• the application of molecular techniques for postulation of slow-rusting Lr genes into the own winter bread wheat germplasm and selection of derivatives of crosses between carriers of these genes and adapted genotypes (MAS).

By carrying this project expected results are:

• to obtain comprehensive information regarding the virulence structure in the current Romanian populations of Puccinia triticina, goal important for the success of any approach, particularly resistance breeding, aimed to limitate the economic losses produced by leaf rust in crop production;

• to exceed the technical and/or scientific barriers of using on a routine base the Molecular Assisted Selection for development of durable type resistance to leaf rust in the Romanian winter wheat breeding program.

The main innovative end result of the project is considered to be the >>development of new pre-breeding gene(s) pools characterized by combined durable adult plant resistance to leaf rust, conferred by slow-rusting Lr genes and improved agronomic traits>>

Reasons for this assumption are:

• the target slow-rusting multiple resistance genes, particularly the new one catalogued from this resistance class, respectively Lr 67/Yr46, havenot been up to now systematically introduced into adapted global winter wheat germplasm;

• the current winter wheat Romanian germplasm includes perspective genotypes with improved agronomic traits, but in order to be efficiently cultivated under diverse projected scenarios of climate change, introduction of durable multiple resistance to the most air borne distributed pathogens, is crucial.

The new pre-breeding gene(s) pool(s) generated by this project contribute to the diversification of genetic substrates of resistance to leaf rust in the Romanian wheat breeding germplasm, currently exploited to release new cultivars, economically and socially competitive on wheat market, at national and international level.