CEEX 23

Denumirea proiectului: Îmbunatatirea calitatii furajului la lucerna prin modificarea arhitecturii plantei cu ajutorul metodelor biotehnologice

(english version)

Sursa de finantare: Bugetul de Stat – Ministerul Educatiei si Cercetarii, Programul ”Cercetare de excelenta”

Autoritatea contractanta:

Centrul National de Management Programe –Programul Biotech Contractor: Institutul National de Cercetare –Dezvoltare Agricola Fundulea

Categoria de proiect: Modulul 1- Proiecte de Cercetare – Dezvoltare Complexe, tipul de proiect P–CD

Valoarea contractului: 1.222.000 lei - din care:

Durata contractului: 3 ani (oct. 2005 – oct. 2007)

Parteneri

Coordonator proiect: Institutul National de Cercetare – Dezvoltare Agricola – Fundulea, str. N.Titulescu. nr. 1, 915200, Fundulea , tel. +40213154040, fax. +40242642044, E-mail: schitea@ricic.ro, web site: www.incda-fundulea.ro

Director proiect: Dr. Ing. Maria SCHITEA

Partener 2: Institutul de Biologie – Bucuresti, Splaiul Independentei, nr. 296, 060042, BUCURESTI, Tel/fax:2239072/221, 2219071, e-mail: ancuta_paun@yahoo.com, www.ibiol.ro Responsabil stiintific: Dr. Biolog Anca PÃUNESCU

Partener 3: Universitatea de Stiinte Agronomice si Medicina Veterinara a Banatului –Timisoara Calea Aradului, nr. 119, cod 1900, Timisoara, tel: +40-(0)256-494023, fax: +40- (0)256–200296, e-mail:elenamarcelabadea@yahoo.com, clasor_ro@yahoo.com, site web: http://www.usab-tm.ro

Responsabil stiintific: Prof.univ.dr. Elena Marcela BADEA

Partener 4: Institutul National de Biologie si Nutritie Animala Balotesti – Sector Cercetare Calea Bucuresti, nr. 1, BALOTESTI, tel/fax +40-(0) 213512084/3512080, e-mail: dihoru.alexandrina@ibna.ro, www.ibna.ro

Responsabil stiintific: Dr. Biolog Alexandrina DIHORU

Partener 5: Institutul National de Biologie si Nutritie Animala Balotesti – Ferma Agrozootehnica Calea Bucuresti, nr. 1, BALOTESTI, tel/fax +40-(0) 213512084/3512080, e-mail: dihoru.alexandrina@ibna.ro, www.ibna.ro

Responsabil stiintific:Ing. Calin ALEXANDRU  

Echipa de cercetare

Dr. Ing. Maria SCHITEA – Director proiect
Dr. Ing. Elena PETCU
Dr. Ing. Florentina RÃDUCANU
Ing. Domnica BADEA
Ing. Valentin EPURE CRISTEA
Ing. Constantin STAN
Ec. Miorita ARION
Dr. Biolog Anca PÃUNESCU – Responsabil Stiintific –partener 2
Prof. Univ. Dr. Biolog Elena Marcela BADEA
Prof. Univ. Dr. Biolog Elena Marcela BADEA - Responsabil Stiintific –partener 3
Sef lucrari Dr. Sorina MIHACEA
Conferentiar Dr. Dorica BOTARU
Ing. Drd. Cerasela DRÃGOESCU
Ing. Drd. Oana BOLDURA
Dr. Biolog Alexandrina DIHORU - Responsabil Stiintific –partener 4
Dr. Ing. Ilie VOICU Dr. Ing. Rodica Diana CRISTE
DR. Ing. Margareta OLTEANU
Ing. Dorica VOICU
Dr. Ing. Catalin DRAGOMIR
Ing. Calin ALEXANDRU - Responsabil Stiintific –partener 5  

Obiectivele proiectului

• transferul markerilor moleculari de la Medicago truncatula la Medicago sativa, germoplasma adaptata la conditiile din România;
• constructia unei harti de linkage la lucerna tetraploida din România;
• identificarea markerilor moleculari linkati cu caractere importante agronomic;
• educarea si formarea unor specialisti care sa utilizeze tehnicile moleculare în procesul ameliorarii.
• amplificarea variabilitătii genetice prin regenerarea plantelor din celule cultivate „in vitro”.  

Lucrări publicate pe baza cercetărilor efectuate în cadrul proiectului

1. PETCU Elena, SCHITEA Maria, BADEA  Domnica,  2006 -  A preliminary method of screening for soil acidity tolerance in Alfalfa, Proc. of Eucarpia Meeting  Medicago Group (Breeding and seed production for conventional and organic agriculture), pag 360-365, Perugia, Italia, 3-7 sep.2006. ISBN-978-88-87652-12-3.

2.  PETCU Elena, SCHITEA Maria, BADEA Domnica, 2006 – The effect of drought on some Romanian alfalfa genotypes, Proc. of Rom. Acad., Series B, 2006, 2-3, PAG. 127-129. ISSN 1454-8267.

3. Paunescu Anca, Hongyan Zhu, Muqiang Gao, Maria Schitea , Elena Badea, 2006 - Breeding of tetraploid Medicago sativa L. using microsatellites markers developed from Medicago truncatula Gaertn. Sequences, Danemarca, Aarhus, la a  “7th European Nitrogen Fixation Conference”.

4. Mihacea S., Boldura O., Schitea M., Badea E., 2007 -  Researches regarding DNA sequence variability for different alfalfa genotypes, Proceeding of the International Conference “ Agricultural and Food Sciences, Process and Technologies, Sibiu, pag. 247-253.

5. Boldura O., Mihacea S, Schitea M., Badea E., The polymorphism identification between mapping population possible parents using RAPD markers, Proceeding of the International Conference “Agricultural and Food Sciences, Process and Technologies, Sibiu, 2007, pag. 59-65.

6. Dragoescu C., Mihacea S., Badea E., Costan A., Nedelea G., Studies concerning the in vitro regeneration capacity among different Romanian alfalfa genotypes, Proceeding of the International Conference “ Agricultural and Food Sciences, Process and Technologies, Sibiu, 2007, pag. 139-143.

7. Boldura O.,  Mihacea S, Schitea M., Badea, Genetic mapping in alfalfa  ( Medicago sativa ) with microsatellites markers, CERCETĂRI STIINŢIFICE , SERIA A XI - A, U.S.A.M.V.B.T., Ed. Agroprint, Timişoara, 2007, pag.479-484.

8. Mihacea S., Badea E., Boldura O., Schitea Maria,, CERCETARI PRIVIND CARTAREA GENETICA LA Medicago sativa, lucrare prezentata laSIMPOZIONUL Realizari in cercetarea stiintifica din biotehnologie obtinute prin Programul CEEX - modulul 1, BIOTECH, Iasi, 30 mai -1 iunie 2007.

9. PÃUNESCU Anca, SCHITEA Maria, BADEA Elena, 2007 –Transfer of Simple Sequence Repeat (SSR) Markers from Medicago truncantula Gaertn to Romanian Tetraploid Medicago sativa L. for germoplasm characterisation and evalution „Biotechnology in agriculture - present challenges and beyond”, USAMV Bucuresti.

Rezumat

Lucerna este cea mai importantă leguminoasă furajeră perenă cultivată în lume,  inclusiv în Romania. În perioada 1989-2007, suprafaţa ocupată cu lucernă în ţara noastră a oscilat între 350.000 si 450.000 ha, ceea ce echivalează cu 29,7 şi, respectiv, 31,6% din suprafaţa pe care sunt cultivate plante furajere şi peste 5% din suprafaţa arabilă a României.
La Institutul Naţional de Cercetare – Dezvoltare Agricola Fundulea, in cadrul programului  de ameliorare a lucernei, se urmăreşte crearea de soiuri care să producă o cantitate cât mai mare de substanţe utile pe unitatea de suprafaţă, însuşire care depinde de capacitatea de producţie pentru furaj, de calitatea acestuia şi de toleranţa la factorii de stres biotic şi abiotic. O parte dintre aceste deziderate au fost şi obiectivele prezentului proiect de cercetare  pentru a căror îndeplinire au fost utilizate atât metode convenţionale cât şi metode biotehnologice (markeri moleculari şi cultura in vitro). Introducerea metodelor care aparţin biotehnologiei în programul de ameliorare a lucernei, ca supliment al metodelor convenţionale, este menită să contribuie la eficientizarea acestui demers.
La Institutul Naţional de Cercetare – Dezvoltare Agricola  Fundulea au fost utilizate metode convenţionale de ameliorare în scopul acumulării în genotipuri noi, cu fenotip multifoliolat, a genelor utile implicate în controlul producţiei şi calităţii furajului, al toleranţei/rezistenţei la factorii de sters biotic şi abiotic. În vederea identificării unor markeri moleculari linkaţi cu fenotipul multifoliolat, a fost creată o populaţie de cartare. Formele parentale au fost alese pe baza polimorfismului caracterelui multifoliolat, a însuşirilor agronomice superioare, ca şi pe baza valoarii nutritive ridicate şi a rezistenţei la boli:
        P1 = 71001/17 x 71048/5 ( MF 42-96 x MF 42-96 )
        P2 = 71024/12 x 71008/5 [ C3  40-72 x  ( MF 42-96 x MF 42-96)]
În scopul identificării unor genotipuri tolerante la aluminiu şi implicit, pretabile pe soluri acide, a fost utilizată tehnica de selecţie in vitro. În plus, a fost evaluată toleranţa la salinitate şi la stresul hidric a germoplasmei utilizate în ameliorare, inclusiv a populaţiei de cartare. Concret, a fost determinată eficienţa utilizarii apei prin determinarea transpiraţiei cuticulare, a raportului frunze/tulpini, a conţinutului relativ de apă, de clorofilă şi a capacităţii osmotice. Au fost optimizate metodele de screening ale rezistenţei la secetă şi de stabilire a corelaţiei între rezistenţa la secetă şi rezistenţa la alţi factori de stres abiotic.
Conform obiectivelor propuse, cercetările efectuate au avut ca rezultat crearea şi selecţia unui bogat material de ameliorare, cu amplă variabilitate fenotipică şi genotipică. Au fost selecţionate 2500 până la 3000 de plante/an, descendenţe elită cu frunza multifoliolată, cu ritm rapid de creştere după rasărire, cu capacitate bună de lăstarire şi cu sistem radicular bine dezvoltat.
Gradul de homozigoţie al fenotipului multifoliolat a fost mărit prin  autopolenizarea  plantelor elită cu capacitate mare de fructificare (10 -15 consangvinizări/an).  Acumularea genelor care conferă calitate furajului a fost obţinută  prin hibridari între linii consangvinizate cu frunză multifoliolată (5 până la 12 hibridări/an).
 La descendenţele elită testate, inclusiv la populaţia de cartare, a fost determinată frecvenţa fenotipului multifoliolat şi a fost calculat raportul frunze/tulpini. Au fost selecţionate 350 de descendenţe elită cu un grad mare de rezistenţă la boli, în principal la vestejirea fuzariană (Fusarium oxysporum).
Rezultatele cercetările care au avut ca obiectiv selecţia unor genotipuri tolerante la secetă au evidenţiat o variabilitate foarte mare a acestei însuşiri în germoplasma studiată, mult mai mare decît la martor (Petcu et al. 2008). Analiza varianţei efectului stresului hidric şi salin asupra acumulării de biomasă la lucernă a evidenţiat influenţa foarte semnificativă a tratamentului, a genotipului şi a interacţiunii acestora. Cantitatea de biomasă a scăzut cu  peste 37% în condiţiile unei salinităţi relativ mari  şi cu pînă la 73% în condiţii de stres hidric. Efectele stresului hidric şi celui salin asupra cantităţii de  biomasă produse au fost aditive, dar nu şi egale.
Pentru identificarea unor genotipuri tolernte la aluminiul din sol şi/ sau rezistente la patogenul care produce  vestejirea fuzariană (Fusarium oxysporum), au fost utilizare metode neconvenţionale. Mai precis, pentru identificarea genotipurilor rezistente la vestejirea fuzariană, materialul supus selecţiei a fost cultivat in vitro  pe un mediu de creştere adiţionat cu acid fusaric.  A fost selecţionat cultivarul Topaz, al cărui  potenţial de regenerare a permis, ulterior, obţinerea prin embriogeneză somatică a 226 de somaclone. Din cele 17 genotipuri evaluate, au fost selecţionate  152 de plante tolerante la aluminiu, care au fost trecute în în câmp pentru parcurgerea unui nou ciclu de selecţie.
La Institutul Naţional de Cercetare –Dezvoltare pentru Nutriţie Animală Baloteşti, a fost evaluată valoarea nutritivă a furajului produs de genotipurile de lucernă selecţionate. Valorile medii înregistrate timp de doi ani au permis selecţia descendenţelor D-24032, D-24027. Coeficienţii de digestibilitate ai acestora au fost  de  73%,  respectiv, 74%, energia netă a fost de 1468 şi, respectiv, de 1493 kcalorii, iar  unităţile nutritive ovăz au fost de 1,03 şi, respectiv, de 1,04.  La soiul martor Selena coeficientul de digestibilitate a fost de 72%, energia netă – de 1409 kcalorii, iar unităţile nutritive ovăz au fost de 0,99. Diferenţe în favoarea noilor genotipuri au fost înregistrate, de asemenea, în privinţa componentelor pereţilor celulari, exprimate în NDF şi ADF, precum şi  în privinţa conţinutului de proteină brută.
            La Universitatea de Stiinţe Agronomice şi Medicină Veterinară a Banatului – Timişoara,  principalul obiectiv al cercetărilor a constat în realizarea unei hărţi genetice la o populaţie de Medicago sativa tetraploidă prin transferul de markeri moleculari de la Medicago truncantula şi de la specia de Medicago sativa diploidă.
            Cercetările au fost efectuate prin metode specifice biologiei moleculare. Acidul dezoxiribonucleic (ADN) a fost extras prin metoda CTAB, iar pentru amplificare au fost utilizaţi primeri specifici de la specia Medicago truncantula.  Atunci cînd au fost utilizaţi  markeri CAPS, pentru digestie s-a recurs la  enzime de restricţie specifice.
            Au fost analizate 150 de plante din populaţia de cartare F1. Pentru asigurarea continuităţii cercetărilor, populaţia de cartare a fost menţinută în seră şi în  cultură in vitro. Genitorii şi descendenţele F1 din populaţia de cartare au făcut obiectul caracterizării  pentru principalele însuşiri fenotipice.
            Au fost utilizaţi 18 markeri dominanţi RAPD (Random Amplifed Polymofhic DAN), 27 de markeri SSR (Single Sequence Repeat)  şi 23 de markeri CAPS (Cleared Amplified Polymorphic DAN), majoritatea identificaţi la Medicago truncantula, specie leguminoasă model pentru genetica moleculară. Rezultatele obţinute au evidenţiat posibilitatea transferului markerilor moleculari identificaţi pe harta genetică de la Medicago truncantula la populaţia de cartare studiată (Mihacea şi colab. 2007, Boldura şi colab. 2007-a, 2007-b).
            Pentru introducerea în softul de cartare a markerilor moleculari identificaţi la circa 100 de plante din populaţia de cartare, a fost folosit metoda Colormap, o metodă de cartare relativ simplă, care permite obţinerea unor  rezultate bune fără să fie nevoie de aplicarea metodelor matematice sau a softurilor specifice. Din cauza genomului poliploid şi a abundenţei secvenţelor repetate, nu a fost posibilă cartarea în populaţia F1. Având în vedere faptul că obiectivul cercetărilor era identificarea unor markeri linkaţi cu fenotipul multifoliolat, a fost aplicată analiza segregării în amestec (Bulked SegreGant Analysis –BSA). Aplicarea acestei metode  presupune existenţa unei populaţii care segregă pentru gena de interes, deoarece unul dintre părinţi posedă o alelă mutantă. Markerii moleculari la nivelul cărora se determină polimorfismul trebuie să fie apropiaţi de gena de interes şi, ca urmare, să segrege împreună cu aceasta.
            Au fost analizate două tipuri de ADN cu 18 markeri RAPD şi 94 markeri SSR. Tipurile de ADN  au provenit de la plante cu fenotip multifoliolat şi de la plante cu frunze normale, toate obţinute prin autofecundarea unei plante din populaţia de cartare F1. Markerii au fost aleşi pe baza rezultatelor anterioare, proprii sau comunicate în literatura de specialitate, care-i semnalează ca adecvaţi pentru lucerna tetraploidă.  Amplificând  acelaşi fragment la ambele tipuri de ADN, markerii utilizaţi  nu sunt linkaţi cu fenotipul multifoliolat.
            Date recente sugereză faptul că arhitectura frunzei ar putea fi rezultatul supraexpresiei genei 1KNOTTED (KNOX1) (Campagne şi colab., 2008), ceea ce ar  face din identificarea markerilor linkaţi cu locusul implicat în determinarea fenotipului multifoliolat o falsă problemă.  În cazul lucernei, aceste cercetări au caracter de pionierat în Romania, iar rezultatele lor constituie o bază pentru studii de cartare în populaţii segregante pentru diferite caractere care prezintă interes în procesul de  ameliorare a acestei specii.
La Institutul de Biologie Bucureşti, obiectivul cercetărilor a fost evaluarea si ameliorarea unor linii autohtone de Medicago sativa tetrapliodă prin tehnici moleculare.
Intr-o prima etapă, au fost consultate informaţiile disponibile în publicaţiile de specialitate şi în bazele de date în format electronic în privinţa stadiului actual al cunoaşterii genului Medicago la nivel molecular. Au  fost sistematizate datele privind markerii moleculari polimorfi identificaţi la speciile de Medicago.
Apoi, au fost selecţionaţi 97 de markeri specifici de tip SSR polimorfici la M.truncatula în vederea testării lor la populaţii autohtone de lucernă. Dintre acestia doar 24 (16 genomici si 8 genici) au generat polimorfism la germoplasma autohtonă tetraploidă de Medicago sativa. Markerii transferaţi - 24 de markeri SSR si 7 markeri RAPD-  au fost utilizaţi pentru caracterizarea populatiei de cartare. Rezultatele au demonstrat faptul că populaţia a fost destul de uniformă din punct de vedere genetic, valorile similarităţii genetice calculate pe baza profilelor SSR  variind  intre 1.000 şi 0.790. Aceste rezultate au fost confirmate si de valorile calculate pe baza profilelor RAPD, care au fost cuprinse intre 0.986 si 0.882.
Din populaţia de cartare au fost selecţionate 54 de genotipuri de Medicago sativa care au manifestat rezistenţă la unii factori de stres abiotic sau biotic, precum si 6 genotipuri care au manifestat polimorfism în privinţa toleranţei la prezenţa aluminiului în substrat (4 genotipuri tolerante şi 2 sensibile).  Dintre markerii  transferati, primerul de tip RAPD A04 a generat benzi polimorfice atat la genotipurile tolerante cât şi la cele sensibile la prezenţa aluminiului  in substrat. Markerul RAPD A04 ar putea fi utilizat pentru selectia genotipurilor tolerante la acest tip de stres.
Având in vedere corelaţia pozitivă între grosimea stratului de cutină de la suprafaţa epidermelor organelor aeriene şi gradul de toleranţa la stres, la 54 de  genotipuri selecţionate  pentru toleranţă la factori de stres biotic şi abiotic a fost testat un set de primeri specifici pentru identificarea markerilor  care generează polimorfism pentru caracterul cutină groasă. Rezultatele obţinute au evidenţiat  faptul că primerul (WXP1) ar putea fi folosit, în etapele initiale ale  programelor de ameliorare, ca marker molecular pentru selectarea genotipurilor  potenţial tolerante la diferiţi factori de stres.
În sfârşit, a fost identificat un marker specific  ce amplifică un segment semnificativ din gena  care codifică enzima pectin acetil esteraza (PAE), cu rol în mecanismele moleculare complexe care conferă unor genotipuri  toleranţă la  aluminiul prezent în substrat.

În concluzie, obiectivele propuse în cadrul proiectului  au fost realizate deoarece:

Bibliografie selectivă

1. BOLDURA O., MIHACEA S, SCHITEA Maria., BADEA E., The polymorphism identification between mapping population possible parents using RAPD markers, Proceeding of the International Conference “Agricultural and Food Sciences, Process and Technologies, Sibiu, 2007, pag. 59-65.
2. BOLDURA O.,  MIHACEA S, SCHITEA Maria., BADEA Elena, Genetic mapping in alfalfa  (Medicago sativa ) with microsatellites markers, Cercetări ştiinţifice, Seria A XI – A, U.S.A.M.V.B.T., Ed. Agroprint, Timişoara, 2007, pag. 479-484.
3. Champagne E.M. Connie, Goliber E. Thomas, Wojciechowski F. Martin, Mei W. Raymond, Townsley Brad T., Kan Wang, Margie M. Paz, R. Geeta, Neelima R. Sinha,  ( November 2007) Compound Leaf Development and Evolution in the Legumes, The Plant Cell, Vol. 19: 3369–3378.
4.  MIHACEA S., BOLDURA O., SCHITEA Maria., BADEA E., 2007 -  Researches regarding DNA sequence variability for different alfalfa genotypes, Proceeding of the International Conference “ Agricultural and Food Sciences, Process and Technologies, Sibiu, pag. 247-253.
5. PAUNESCU Anca, HONGYAN Zhu, MUQIANG Gao, SCHITEA Maria, BADEA Elena, 2006 - Breeding of tetraploid Medicago sativa L. using microsatellites markers developed from Medicago truncatula Gaertn. Sequences, Danemarca, Aarhus, la a  “7th European Nitrogen Fixation Conference” pag. 54.
6. PETCU Elena, SCHITEA Maria, BADEA Domnica, 2008 – Identification and selection for drought tolerance in alfalfa (Medicago sativa L), Procc. 18th Eucarpia General Congres, Valencia, Spania,  pag. 451.

 

CEEX 23

IMPROVEMENT OF ALFALFA FORAGE QUALITY BY MODIFING PLANT ARCHITECTURE USING BIOTECHNOLOGICAL METHODS

 Summary

S/T domain: Food, health and well-being: improved quality and safety, both chemical and microbiological, of food.

Financing source: State budget – Ministry of Education and Research,
Program ”Cercetare de excelenta”

Contracting autority:National Center for Projects Management  –CNMP BUCURESTI

Contractor: National Reseach & Development Agricultural Institute –Fundulea

Project type: Modul 1- Complex R&D Projects, P-CD

Contract value: 1.070.000 lei 

Contract duration:  3 years (oct. 2005 – sept. 2007)

Project coordinator: National Reseach & Development Agricultural Institute –Fundulea,
Project Director: PhD. Maria SCHITEA, e-mail: schitea@ricic.ro

Partners:
Partner 1.  :Institute of Biology - Bucureşti, Scientific director of the project: PhD. Anca PÃUNESCU, e-mail: ancuta_paun@yahoo.com;
Partener 2.:  Banat University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Timisoara,  Scientific director of the project: PhD. Elena Marcela BADEA, e-mail: elenamarcelabadea@yahoo.com;
Partner 3.: National Reseach & Development for Biology and Animal Nutrition Institute BALOTEŞTI, Scientific director of the project: PhD Alexandrina DIHORU, e-mail: dihoru.alexandrina@ibna.ro

Alfalfa is the most important and widely grown forage legume in the world. In Romania, during 1989-2007, alfalfa was sown on an area ranging between 350,000 and 450,000 ha, which represents 29.7, 31.6%, respectively, from the basic fodder area, or over 5% from the arable land.
Major objectives for alfalfa (Medicago sativa L.) breeding include improving  yield, forage quality and levels of disease resistance. In order to achieved the project proposed objectives it have been used both conventional and biotechnological methods (molecular markers and in vitro culture).
At National Reseach & Development Agricultural Institute Fundulea, conventional breeding methods for the accumulation of useful genes for traits involved into fodder quality and yield, especially in multi foliated leaf, and for biotic and abiotic stress tolerance/resistance were used.
Mapping population, was also obtained from two parental genotypes chosen based on their polymorphic breeding characteristics like multi foliated leaf, forage digestibility, yield, diseases and pest resistance:
        P1 = 71001/17 x 71048/5 (MF 42-96 x MF 42-96)
        P2 = 71024/12 x 71008/5 [C3 40-72 x (MF 42-96 x MF 42-96)]
In order to identify tolerant/sensitive aluminium genotypes in vitro culture selection techniques were applied. Romanian germoplasm including mapping population were evaluated for variability regarding salt tolerance and water-use efficiency (cuticular transpiration, ration leaves/shoots, relative water content, chlorophyll content), and for osmotic adjustment ability. The methods for screening of the drought resistance and for correlation with other abiotic stress were optimized.
The results of our researches consist in a valuable breeding material with a large genetic and phenotypic variability regarding the characteristics proposed to be improved; so, it was selected 2500-3000 plants/year,  multi foliated leaf elite progenies with rapid growth rhythm after emergence, high tilling ability and well-developed root system.
By self- pollination (10-15 self –pollination /year), it was increase the homozygous level of multi foliated leaf trait in elite progenies, with high fructification ability.  In order to the accumulation of useful genes involved in fodder quality by  crossing, every year it was achieved between 5-12 hybrids, among C1 multi foliated leaf inbreeds lines. It was established frequency of the multi foliated leaf trait and the ratio leaves/stem in tested elite progenies, including mapping population. Also around 350 elite progenies with high level of diseases resistance, especially to Fusarium oxysoorum,  were selected  .
The results of the water-use efficiency evaluation revealed that for all genotypes studied the biomass obtained at each treatment were significantly different from the control (Petcu et al. 2008). The results of analysis of variance showed a very significant influence of treatments, genotype and their interaction regarding the effect of drought and salinity on biomass of alfalfa, but the variance of treatment was higher than the variance due to genotypes. Salt stress significantly decreased biomass over 37 % while hydric stress over 73%. The effect of salt and water stress on yields are additive but not equal.
Unconventional methods were used for the identification of tolerant/ sensitive aluminium genotypes and resistant mutants to the toxic pathogen Fusarium oxysporum. In order to identify (Medicago sativa L.) resistant mutants four Romanian genotypes of alfalfa were used. By indirect somatic embryogenesis 226 plants from cultivar Topaz were regenerated. Topaz has high ability for callusing, in vitro regeneration, and is resistant to fusaric acid. 152 plants from 17 genotypes with tolerance to aluminium were selected. These plants  were exposed on the second cycle of selection.
At National Reseach & Development for Biology and Animal Nutrition Institute Balotesti was evaluated the nutritive quality of the forages produced by alfalfa genotypes. The results revealed that, on the average of two years, the digestibility coefficient for D - 24032, D - 22027 and for control Selena cultivar was 73.0%, 74.0%, and, respectively, 72%. The net energy values registered for D -24032, D-22027 genotypes (1468-1493 kcal) were higher then for cultivar Selena (1409). The fodder units varied between 1.03 at D -22027 and 1.06 at D- 22032 and for control cultivar was 0.99. The differences between the new genotypes and the control regarding NDF, ADF and CP suggest an improving of the fodder value.
At Banat University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Timisoara, the main goal of the researches was to develop a genetic linkage map for a tetraploid Medicago sativa population by transferring the molecular markers from Medicago truncatula’s and diploid Medicago sativa’s genetic maps which were already established and to identify the likage status of genic sequence that confer the multi foliated trait. The experiments were based on specific molecular biology methods. The DNA was extracted using CTAB method and was amplified with specific primers, following specific conditions. When the CAPS method was applied the digestion was performed using the recommended restriction enzymes.
For obtaining F1 mapping population seeds were germinated and 150 individual plants were taken. To insure a continuous available material for phenotypic characterization individual plants were maintained in the greenhouse and in vitro culture. Parental genotypes and individuals from the mapping population were analyzed for their phenotypic characteristics.
To identify the molecular markers which emphasize polymorphism between the parental forms, 18 dominant RAPD markers (Random Amplified Polymorphic DNA), 27 codominant microsatelit (SSR) markers and 23 CAPS markers (Cleaved Amplified Polymorphic DNA), most of them identified in the model legume Medicago truncatula map, were used. The transfer of molecular markers identified on Medicago truncatula’s genetic map to selected alfalfa individuals was successfully (Mihacea et al.2007, Boldura et al. 2007-a, 2007-b).
About 100 individuals from the F1 generation were studied and the results were analyzed using the Colormap software. Because of the polyploidy and the high rate of repetitive sequences of this species, the mapping in the F1 generation was very difficult. Taking into account that the interest in the present research was to find out markers linked with multi foliated character, the Bulked Segregant Analysis (BSA) method was applied.
By self-pollination of a selected multi foliated individual from the F1 generation, F2 segregating population necessary for Bulked Segregant Analysis (BSA), was obtained. The F2 plants were grouped according to the expression of the interest trait. Two types of bulk DNA was extracted – from three foliated (86 % from the individuals) and from multi foliated plants (14% from the individuals). The two bulks are therefore genetically dissimilar in the selected region but seemingly heterozygous at all other regions. The two types of DNA, named B1 and B2, were analyzed with different molecular markers. We used 18 RAPD and 94 SSR markers primers both selected as results of our research and mentioned in the literature as valuable on tetraploid alfalfa maps. From both DNA types, all the mentioned markers amplified the same fragments. No molecular markers linked with the interest trait was identified. The most recent data (Campagne et al.2007) suggest that the leaf architecture could be a result of some gene overexpression and in this case the identification of a gene responsible for this trait it is not possible.
Although the identification of markers linked with the multi foliated trait was unsuccessfully, the results can be used for the future mapping analysis of populations segregating for different useful characters. The molecular techniques RAPD (Random amplified polymorphic DNA), SSR (single sequence repeat) and CAPS (Cleaved Amplified polymorphic DNA) were optimized for using in tetraploid alfalfa analysis. Some molecular markers from the Medicago truncatula  and diploid Medicago sativa genetic maps were transfer on the genetic map of the population created in this project. The BSA (Bulk Segregant Analysis) technique, which allow the identification of the markers linked with an interest trait, was also optimized.
At the Institute of Biology from Bucharest, molecular techniques in autochthonous tetraploid Medicago sativa germplasm was applied. In a first stage, data on polymorphic molecular markers for Medicago genus was summarized. From 97 SSR polymorphic markers on M. truncatula tested on M. sativa only 24 (16 genomic and 8 genic) was polymorphic for both species. Using the transferred markers (24 SSR and 7 RAPD) the mapping population (150 individuals) was characterized. The results shows that the genetic similarity within the  mapping population is low, varying from 1.000 to 0.790, as the SSR test shows, and from 0.986 to 0.882 as  RAPD test shows,  respectively.
From the mapping population 54 genotypes stress tolerant was selected. Among the transferred markers, the RAPD primer named A04 shows polymorphism to aluminium resistance and could be used in marker-assisted selection for aluminium tolerant genotypes. Considering the positive correlation between the cuticle layer development and stress tolerance, a polymorphic PCR primer belonging to WXP1class was identified. This marker could be very useful in screening programs for stress tolerance. A specific marker which amplify a significant fragment of pectin acetyl esterase (PAE) was identified. PAE genes are recently reported as being involved in aluminum tolerance and the identified marker could be successfully used for this type of stress tolerance screening. The comparative analysis between the electrophoretic profile generated from specific markers (WXP1 and MtB287) and from the unspecific ones (A01 and A04) as well, reveals that the mapping population and the somaclonal variants exhibits the same linkage groups.
The results obtained revealed that some molecular markers from the Medicago truncatula and diploid Medicago sativa genetic maps could be transferd on the genetic map of the population created in this project.
The molecular techniques RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), SSR (Single Sequence Repeat) and CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic DNA) were optimized for using in tetraploid alfalfa analysis. The BSA (Bulk Segregant Analysis) technique, which allow the identification of the markers linked with an interest trait, was also optimized.
Although the identification of markers linked with the multi foliated trait in our mapping population was unsuccessfully, the results can be used for the future mapping analysis of populations segregating for different useful characters.
In conclusion, a valuable materials both with multi foliated leaf and with traits useful for feed quality improvement were obtained. By utilization of these materials in breeding programs, new alfalfa cultivars with modified architecture will be created.

Selective papers:
1. BOLDURA O., MIHACEA S, SCHITEA Maria., BADEA E., The polymorphism identification between mapping population possible parents using RAPD markers, Proceeding of the International Conference “Agricultural and Food Sciences, Process and Technologies, Sibiu, 2007, pag. 59-65.
2. BOLDURA O.,  MIHACEA S, SCHITEA Maria., BADEA Elena, Genetic mapping in alfalfa  (Medicago sativa ) with microsatellites markers, Cercetări ştiinţifice, Seria A XI – A, U.S.A.M.V.B.T., Ed. Agroprint, Timişoara, 2007, pag. 479-484.
3. Champagne E.M. Connie, Goliber E. Thomas, Wojciechowski F. Martin, Mei W. Raymond, Townsley Brad T., Kan Wang, Margie M. Paz, R. Geeta, Neelima R. Sinha,  ( November 2007) Compound Leaf Development and Evolution in the Legumes, The Plant Cell, Vol. 19: 3369–3378,
4.  MIHACEA S., BOLDURA O., SCHITEA Maria., BADEA E., 2007 -  Researches regarding DNA sequence variability for different alfalfa genotypes, Proceeding of the International Conference “ Agricultural and Food Sciences, Process and Technologies, Sibiu, pag. 247-253.
5. PAUNESCU Anca, HONGYAN Zhu, MUQIANG Gao, SCHITEA Maria, BADEA Elena, 2006 - Breeding of tetraploid Medicago sativa L. using microsatellites markers developed from Medicago truncatula Gaertn. Sequences, Danemarca, Aarhus, la a  “7th European Nitrogen Fixation Conference” pag. 54.
6. PETCU Elena, SCHITEA Maria, BADEA Domnica, 2008 – Identification and selection for drought tolerance in alfalfa (Medicago sativa L), Procc. 18th Eucarpia General Congres, Valencia, Spania,  pag. 451.